氟是一种卤族化学元素，多以氟化物的形式广泛存在于自然界。氟作为人体必需的微量元素之一，每日约需1.0~1.5 mg，在生理代谢过程中，发挥着不可替代的作用。人与动物可从多种途径摄入氟，当体内的氟含量增多导致机体器官损伤时，称为地方性氟中毒(地氟病)。氟中毒时可干扰肝细胞的正常生理功能，引起肝脏结构、功能异常^{[1, 2, 3, 4]}。研究表明刺猬(hedgehog，Hh)信号通路可以在氟中毒大鼠肝脏中表达^[5]。本研究通过饮水方式制备大鼠慢性氟中毒模型^[6]，观察Hh信号通路在氟中毒大鼠肝脏中表达变化及意义，结果报告如下。

4~5周龄、健康Sprague-Dawley(SD)大鼠36 只(第三军医大学大坪医学动物实验中心，许可证号：SCXK(渝)2007-0005，饲养1周后按体重随机分为3组，每组12只，雌雄各半；对照组大鼠饮用自来水(含氟量<2 mg/L)；低、高氟组大鼠饮用含氟化钠的自来水(含氟量分别为5、50 mg/L)；喂养6个月后股动脉放血(取血清-80 ℃冰箱保存)处死大鼠。取肝脏左叶组织，部分4%中性甲醛固定，余放于-80 ℃冰箱保存待用。

染氟结束时用代谢笼收集大鼠24 h尿液，氟离子选择电极法测定尿氟含量，处死大鼠后，分离右后肢股骨，采用灰化-氟离子选择电极法测定骨氟含量。

取保存于-80 ℃血清，采用自动生化仪检测各组大鼠血清中谷草转胺酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙转胺酶(alanine transaminase，ALT)的活性及总蛋白、白蛋白含量。

采用苏木素-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色法，取适量4%中性甲醛浸泡的肝组织做石蜡切片，脱蜡至水洗后苏木精染色2 min，1％盐酸酒精分化20 s，1％碳酸锂反蓝30 s，伊红染色30 s，梯度酒精脱水，透明、封片，在光镜下观察大鼠肝脏组织的形态学改变。

(1)免疫组化envision二步法：石蜡切片常规脱蜡至水，3%H₂O₂孵育20 min，高压修复2.5 min，取出自然冷却至室温，封闭液孵育20 min，滴加Ihh、Smo、Gli1(1：100)稀释的一抗4 ℃过夜。次日取出复温5 min，依次加入二抗及辣根过氧化物酶分别孵育25 min；二氨基联苯胺显色，流水终止反应；苏木素复染，脱水、透明、封片。以磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered Saline，PBS)代替一抗作为空白对照。Ihh、Smo、Gli1阳性反应为细胞浆及细胞核出现黄色或棕黄色颗粒，采用BIOMIAS-2001分析软件测定每张标本中Ihh、Smo、Gli1积分光密度(IOD)，IOD值高低与阳性表达成正比。(2)Western blot法：提取大鼠肝脏组织蛋白，采用二喹啉甲酸(bicichoninic acid，BCA)法进行蛋白定量，蛋白经SDS-PAGE分离后，转到聚偏氟乙烯膜，用5%牛血清蛋白封闭1 h，4 ℃孵育一抗 Ihh、Smo、Gli1(1：200)过夜，次日室温孵育二抗(1:3 000)1 h，曝光显影，以β-actin蛋白条带作为内参照进行Image J灰度分析。

采用real-time-PCR法，取肝脏组织于研磨器中研磨，加入 Trizol试剂，按常规方法提取肝组织RNA。按照反转录试剂盒说明书进行RT-PCR反应。以β-actin作为内参，Ihh、Smo、Gli1引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。Ihh上游引物：5′-GCCCAGGTCCACCTAGAAAC-3′，下游：5′-CTCTCA GCCTGTTTGGCTCA-3′；Smo上游：5′-ATGCGTGTTTCTTTGTGGGC-3′，下游：5′-ACACAGGATAGGGTCTCGCT-3′；Gli1上游引物：5′-TGGAAGG GGACATGTCTAGC-3′，下游： 5′-GCTCACTGTTGATGTGGTGC-3′；β-actin上游引物：5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游： 5′-AGCCA CCAATCCA CACAGAG-3′。PCR反应体系为20 μL，反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；共40个循环，60 ℃ 10 min终止反应，PCR产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶成像系统进行扫描分析。

采用黄嘌呤氧化酶法测定肝组织中T-SOD活力，化学比色法测定GSH-Px和GS活力，硫代巴比妥酸法测定LPO含量。

饲养期间，对照组大鼠皮毛光滑，食欲良好，活跃，牙齿无明显病变；随染氟时间延长，低氟组大鼠出现食欲减退，活动度下降，皮毛无光泽，牙齿有轻微白垩改变；高氟组大鼠精神萎靡、嗜睡，食欲减退，运动明显减少，皮毛无光泽，牙齿白垩改变明显。

表 1

表 1 染氟对大鼠骨氟、尿氟含量影响(x±s，n=12) 组别(mg/L) 尿氟(μg/mL) 骨氟(μg/g) 对照组 1.08±0.18 0.92±0.14 染氟组 5 3.25±0.47a 8.57±0.88a 50 8.05±0.60ab 23.30±2.71ab 注：与对照组比较，a P<0.05；与5 mg/L染氟组比较，b P<0.05。

表 1 染氟对大鼠骨氟、尿氟含量影响(x±s，n=12)

与对照组比较，随染氟剂量升高，染氟组大鼠骨氟、尿氟含量逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量效应关系。

表 2

表 2 染氟对大鼠肝功能影响(x±s，n=12) 组别(mg/L) ALT(U/L) AST(U/L) 总蛋白(g/L) 白蛋白(g/L) 对照组 37.72±3.63 121.82±9.14 83.32±4.27 40.99±3.49 染氟组 5 52.96±2.57a 135.07±10.85a 71.22±7.93a 38.66±3.84 50 73.42±6.98ab 161.08±8.59ab 66.88±5.33a 29.92±1.97ab 注：与对照组比较，a P<0.05；与5 mg/L染氟组比较，b P<0.05。

表 2 染氟对大鼠肝功能影响(x±s，n=12)

与对照组比较，随染氟剂量升高，染氟组大鼠血清中ALT和AST活性逐渐升高，呈剂量效应关系(P＜0.05)；与对照组比较，低、高剂量染氟组大鼠血清中总蛋白、白蛋白含量逐渐降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

光镜观察显示，对照组大鼠肝脏细胞大小一致，细胞排列呈条索状，以中央静脉为中心呈放射状分布；低氟组大鼠肝细胞索排列紊乱，肝细胞肿大，部分肝细胞胞浆透明，呈水样变性；高氟组大鼠肝脏可见肝索紊乱，细胞高度水肿呈气球样改变，部分肝细胞轮廓不清，部分肝细胞膜消失或可见核固缩。

表 3

表 3 染氟对大鼠肝组织中Hh信号通路因子蛋白表达影响 (x±s，n=12) 组别(mg/L) Ihh Smo Gli1 对照组 25.42±2.82 34.28±4.50 32.59±2.88 染氟组 5 45.60±5.69a 55.39±6.36a 78.97±8.02a 50 71.41±4.18ab 83.83±5.26ab 81.14±25.44a 注：与对照组比较，a P<0.05；与5 mg/L染氟组比较，b P<0.05。

表 3 染氟对大鼠肝组织中Hh信号通路因子蛋白表达影响 (x±s，n=12)

图 1

注：1~3：分别为对照组、低、高剂量染氟组。 图 1 染氟对大鼠肝组织中Hh信号通路因子蛋白表达影响

免疫组化结果显示，对照组大鼠肝组织中Ihh、Smo、Gli1蛋白表达较少，细胞着色较少，颜色较淡；与对照组比较，随染氟浓度增加Ihh、Smo、Gli1蛋白表达的细胞数目增多，颜色加深；差异有统计学意义(P<0.05)(表 3)；Western blot结果显示，与对照组比较，各剂量染氟组大鼠肝组织中Ihh、Smo、Gli1蛋白表达明显增加(图 1)。

表 4

表 4 染氟对大鼠肝组织中Hh信号通路因子mRNA表达影响 (x±s，n=12) 组别(mg/L) Ihh Smo Gli1 对照组 0.39±0.04 0.38±0.06 0.52±0.12 染氟组 5 0.78±0.12a 0.65±0.06a 1.43±0.19a 50 1.20±0.17ab 3.13±0.19ab 5.35±0.52ab 注：与对照组比较，a P<0.05；与5 mg/L染氟组比较，b P<0.05。

表 4 染氟对大鼠肝组织中Hh信号通路因子mRNA表达影响 (x±s，n=12)

图 2

注：1~3：分别为对照组、低、高剂量染氟组。 图 2 染氟对大鼠肝组织中Hh信号通路因子蛋白表达影响

与对照组比较，染氟组大鼠肝组织中Hh信号通路因子Ihh、Smo、Gli1 mRNA表达均升高，呈剂量效应关系(P<0.05)。

表 5

表 5 氟对大鼠肝组织中氧化应激指标影响(x±s，n=12) 组别(mg/L) T-SOD (U/mgprot) GSH-Px (U/mgprot) GS (U/mgprot) LPO (μmol/gprot) 对照组 10.33±1.47 11.55±1.78 29.97±3.41 5.96±0.83 染氟组 5 7.35±0.92a 8.88±1.28a 24.63±2.64a 8.14±0.95a 50 5.08±0.64ab 5.53±0.83ab 19.22±1.84ab 10.29±1.81ab 注：与对照组比较，a P<0.05；与5 mg/L染氟组比较，b P<0.05。

表 5 氟对大鼠肝组织中氧化应激指标影响(x±s，n=12)

与对照组比较，各剂量染氟组大鼠肝组织中T-SOD、GSH-Px及GS活性明显降低，LPO含量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，呈剂量效应关系。

肝脏是机体解毒的器官，血清中AST和ALT活性可反映肝脏受损程度，总蛋白和白蛋白可反映肝脏的合成功能。本研究结果显示，与对照组比较，染氟组大鼠尿氟、骨氟含量随染氟浓度增加而升高，血清中AST和ALT活性逐渐增加，而TP和ALB的含量下降；肝组织形态学观察显示，染氟组大鼠肝细胞变性，部分出现坏死、纤维组织增生。与已有结果一致^[7]，表明饮水型慢性氟中毒肝损伤模型制备成功。研究表明慢性氟中毒可导致肝细胞发生变性、坏死、纤维化和凋亡，可能与氧化应激、细胞凋亡、信号通路的激活有关^{[8, 9]}。

Hh信号通路在哺乳动物中存在3个同源基因：sonic hedgehog、Indian hedgehog 和 desert Hedgehog，分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白，其中Ihh蛋白则是软骨内成骨过程中的关键性调节因子；Shh蛋白参与胚胎肢芽不对称性发育和中枢神经系统发育过程，是表达最广泛且潜能最大的同源基因，Dhh则与生殖细胞的发生有关。Hh信号通路存在patched(Ptch)和smoothened(Smo)2种膜蛋白受体。Smo属于G蛋白偶联受体超家族的一员，具有转导Hh信号的作用，是Hh信号向胞内转导的中心环节，负责细胞内信号的传导^[10]。其下游锌指结构转录因子Gli家族有 Gli1、Gli2、Gli3蛋白3个成员，Gli1蛋白是介导或扩大Hh信号反应的激动剂^[11]，激活时可诱导目标基因表达；Gli2、Gli3功能复杂，在不同环境中可对Hh信号起激动或抑制作用^[10]。研究发现，Hh信号通路在肝脏疾病发生、发展中起着重要调节作用^{[12, 13]}，通常情况下，Hh信号通路激活与表达是短暂且受控的，在不同组织、器官需要不同的Hh信号通路表达水平来发挥其正常功能，通路失调可以导致无节制的细胞增殖，引起相应器官功能的严重紊乱^{[14, 15, 16]}。本研究结果显示，随染氟浓度增加，大鼠肝组织中Ihh、Smo、Gli1 蛋白及mRNA表达逐渐增加。提示，Hh信号通路可能与慢性氟中毒肝损伤的发病机制有关。

氟是化学性质极为活泼的元素，机体摄入过量氟后，氟可直接攻击氧，干扰氧代谢导致氧自由基增多，诱导机体发生脂质过氧化，导致抗氧化酶活性降低，造成体内脂质过氧化。SOD/LPO及GSH-Px/LPO比值可作为客观反映体内氧化与抗氧化功能指标^[17]。研究发现氟中毒大鼠血清和肝组织中LPO含量升高，而SOD和GS活性明显降低，表明氟中毒时体内氧化和抗氧化系统失衡，机体脂质过氧化增强而抗氧化能力减弱^{[18, 19]}。研究发现氧化应激损伤可刺激Shh释放，自闭症中氧化应激和Shh可以协同调节丙二醛(MDA)、Bcl-2、SOD、GSH-Px的表达^{[12, 20]}。本研究结果显示，染氟组大鼠肝组织中T-SOD、GSH-Px、GS活力下降，LPO含量升高，表明慢性氟中毒时大鼠体内氧化系统和抗氧化系统失衡，机体脂质过氧化增强而抗氧化能力减弱，从而引起慢性氟中毒大鼠肝组织的损伤。与已有结果^{[21, 22]}一致。提示，Hh信号通路可能与氧化应激共同参与氟中毒肝损害发病过程。