核桃楸树皮、果皮具有抗肿瘤、抗炎和杀虫作用，在中国许多治疗癌症的验方中均含有核桃楸成分。胡桃醌(juglone)又名5-羟基-1,4-萘醌，是一种天然环状醌类，可从胡桃楸的叶及外壳中提取。研究表明，胡桃醌具有促进肝癌，肺癌、前列腺癌、白血病细胞凋亡等作用^{[1, 2, 3, 4]}。卵巢癌是妇科最常见恶性肿瘤之一，死亡率居妇科肿瘤首位。尽管近年来手术及综合疗法的不断改进，对卵巢癌原发病灶的处理有了明显改善，但卵巢癌患者5年生存率仍无明显提高，可能与70%以上的卵巢癌患者诊断时，病变已发生转移有关^[5]。本研究通过观察胡桃醌对人卵巢癌SKOV3细胞的侵袭能力影响，旨在为胡桃醌治疗卵巢癌临床应用提供依据。结果报告如下。

人卵巢癌细胞SKOV3株(吉林医药学院实验中心实验室保存)，属贴壁生长型细胞；胡桃醌、纤维黏连蛋白(fibronection,Fn)(美国Sigma公司)；IMDM (Iscove's modified Dubecco's medium) 培养基及胰酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和MMP-9抗体(美国EPITOMICS公司)；matrigel胶(美国BD Biosciences公司)；Transwell小室(德国Greiner bio-one公司)。

SKOV3细胞株于37 ℃，5% CO₂培养箱中，用IMDM+10%胎牛血清培养，隔日换液，取对数生长期细胞进行实验。实验设对照组、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L组，每组设3个复孔。

采用噻唑蓝(MTT )比色法，取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，体积为200 μL，接种于96孔板内，于37 ℃、5%CO₂条件下培养。加入不同浓度胡桃醌培养液，体外培养24 h后，加入MTT，测定吸光度(A)值，实验重复3次，增殖抑制率(%)=(1-胡桃醌组A值/对照组A值) × 100%。

将纤维黏连蛋白用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)稀释为100 mg/L，每孔100 μL包被于96孔板中，37 ℃包被2 h，用PBS洗涤2次，1%牛血清白蛋白封闭2 h；不同剂量胡桃醌处理细胞24 h，收集细胞，以无血清培养基制成单细胞悬液，调节细胞浓度为3×10⁸个/L，加入包被培养板中，每孔200 μL，置37 ℃、5%CO₂培养箱中孵育2 h；轻轻洗去未黏附细胞，用10%中性甲醛100 μL固定30 min；每孔加0.5% 结晶紫100 μL，室温染色2 h，蒸馏水洗涤1次，阴干后每孔加入2%十二烷基硫酸钠溶液100 μL，酶标仪570 nm波长测定各孔吸光度(A)值。细胞黏附率＝(胡桃醌组A值／对照组A值)×100%。

采用Transwell法，取对数生长期SKOV3细胞，用含0.1%小牛血清的IMDM培养液制成3×10⁸个/L细胞悬液，各组分别吸取200 μL接种于上层小室，将其置于灭菌的24孔板，下室加入含10%小牛血清的IMDM培养液600 μL；培养24 h后，弃去上室原有培养液，分别加入不同浓度胡桃醌，继续培养24 h，将上室面的细胞和matrigel胶用湿棉签擦掉，膜用4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色20 min，PBS冲洗3次，显微镜下观察并拍照；将小室浸没于500 μL 33%醋酸中脱色20 min，测量洗脱液A₅₇₀值，代表穿过细胞数量。

采用Western blot 法，取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上蛋白移至醋酸纤维素膜，于50 g/L 脱脂奶粉中4 ℃封闭过夜，加兔抗MMP-2和MMP-9抗体(1:1000)，小鼠抗β-actin 抗体(1:3000)，4 ℃过夜；Tris-HCL-Tween洗膜，分别加辣根过氧化物酶 标记的山羊抗兔抗体(1:3000)室温避光孵育2 h；TBST洗膜后，加底物发光显影。使用Quantity One软件扫描并做灰度分析。

数据采用(x±s)表示，采用SPSS 11.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

结果显示，以对照组SKOV3细胞增殖率为100%，12.5、25、50、100 μmol/L胡桃醌对SKOV3细胞增殖抑制率分别为(16.8±3.4)%、(39.6±9.7)%、(63.3±13.6)% 和(84.5±17.3)%；与对照组比较，各剂量胡桃醌对SKOV3细胞增殖具有明显抑制作用，且呈剂量效应关系。

表 1

表 1 胡桃醌对SKOV3细胞黏附、侵袭力影响(x±s，n=3) 组别(μmol/L) 黏附率(%) 侵袭力 对照组 66.5±6.2 0.896±0.048 胡桃醌 12.5 57.5±5.6 0.775±0.051 25.0 49.2±6.5a 0.627±0.064a 50.0 37.3±2.9b 0.419±0.018b 100.0 24.7±3.7b 0.165±0.014b 注：与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 1 胡桃醌对SKOV3细胞黏附、侵袭力影响(x±s，n=3)

与对照组比较，胡桃醌浓度≥25 μmol/L时，SKOV3细胞黏附率逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量效应关系；与对照组比较，25、50、100 μmol/L 胡桃醌组穿过matrigel胶的SKOV3细胞数量明显下降，提示胡桃醌浓度≥25 μmol/L时，SKOV3细胞侵袭力逐渐降低。

图 1

注：1：对照组；2~5：胡桃醌12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L组。 图 1 胡桃醌对SKOV3细胞内MMP-2和MMP-9蛋白表达影响

结果显示，对照组、胡桃醌12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L组SKOV3细胞MMP-2和MMP-9表达分别为(0.76±0.04)、(0.65±0.03)、(0.58±0.02)、(0.40±0.02)、(0.24±0.01)与(0.76±0.04)、(0.70±0.03)、(0.59±0.02)、(0.45±0.03)、(0.27±0.02)；与对照组比较，胡桃醌25.0、50.0、100.0 μmol/L组SKOV3细胞内MMP-2表达下降、胡桃醌50.0、100.0 μmol/L组SKOV3细胞内MMP-9表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。

侵袭、转移是恶性肿瘤的重要生物学特性之一，也是肿瘤复发、治疗失败最终患者死亡的主要原因。研究表明，肿瘤的侵袭和转移是多因素和多步骤过程。首先细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM) 黏附，其次通过诱导宿主细胞分泌蛋白酶水解细胞外基质，最后细胞运动和迁移^[6]。纤维粘连蛋白(fibronectine，FN)是基底膜的一种成分，肿瘤细胞从母体脱离后，侵袭基底膜及细胞外基质，通过膜表面受体可粘附于FN上而产生运动与迁移，使肿瘤扩散与转移。除粘附以外，肿瘤细胞在侵袭过程中分泌多种水解酶降解ECM。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)能降解细胞外基质中各种蛋白成分和胞外蛋白，是侵袭过程中主要的蛋白水解酶。一般认为与肿瘤侵袭、转移关系最密切的是MMP-2和MMP-9^[7]。MMP-2和MMP-9活性表达增高，降解基底膜中的Ⅳ型胶原是癌细胞侵袭与转移的关键步骤。

胡桃醌是从核桃楸中提纯的一种天然成分，在体外具有抗肿瘤细胞活性。SKOV3 是能够同时表达MMP-2 和MMP-9 的高转移人卵巢粘液囊腺上皮癌细胞，其MMP-2、MMP-9 表达水平与细胞的恶性程度、侵袭与转移特性、血管内皮生长因子等癌血管生成因子呈正相关^[8]。本研究结果表明，不同浓度胡桃醌可使人卵巢癌SKOV3细胞黏附率下降；Transwell实验证实胡桃醌能够抑制SKOV3细胞穿过matrigel胶的能力，表明胡桃醌能够抑制细胞侵袭；随着胡桃醌剂量增加，SKOV3细胞内MMP-2和MMP-9蛋白表达水平逐渐下降。提示胡桃醌可能通过抑制MMP-2和MMP-9蛋白表达，降低SKOV3细胞黏附与侵袭力。