不动杆菌属(Acinetobacter.spp)是非发酵条件致病菌，当机体抵抗力降低时易引起机体感染，是引起医院内感染的重要机会致病菌之一。自1991 年美国首次报道亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌^[1]以来，全球范围内鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率呈现快速增长，国内外相继有耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌暴发的报道^{[2, 3, 4]} 。New Delhi Metallo-beta-lactamase-1(NDM-1)是一种广谱β-内酰胺酶(碳青霉烯酶)，能够灭活除了氨曲南以外的所有β-内酰胺类药物^[5]。细菌带有blaNDM-1基因后，主要特点是多重耐药，感染该类细菌的患者的临床表现与敏感菌感染没有差别，但治疗上极为困难。因此，对不动杆菌这种院内感染常见的细菌是否携带blaNDM-1基因以及对其耐药机制的研究越来越重要。本研究于2010年从北京地区医院污水筛检出20株产NDM-1的菌株，对其进行了分离鉴定和药敏试验研究。

DYY-6D型电泳仪(北京六一仪器厂)，Sensititre AutoReader(美国Thermo Fisher Scientific公司)，TC-412型PCR仪(英国TECHNE公司)，ExTaq酶、DL2000DNA Marker、6×loading buffer(大连宝生物TAKARA公司)，LB培养基、营养琼脂(北京陆桥公司)，Sensititre非苛养菌药敏板PRCM2F(美国Thermo Fisher Scientific公司)，API 20NE生化鉴定条(法国梅里埃公司)。

2010年从北京地区多家综合性医院采集医院污水，按如下方法进行处理：收集500 mL 研究水样，取其中100 mL 常温下1 000 g 离心10 min，小心倾析上清液，重悬于1 mL 的Luria-Bertani(LB)后取400 μL 接种于含亚胺培南(10 mg/mL)的琼脂培养板上。选取所有对亚胺培南耐药的菌落用API 20NE非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定系统做进一步鉴定，扩增16S rRNA并分析16S rRNA的基因序列。PCR产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序,测序结果通过EditSeq软件进行比对。参照文献^[6]合成引物(表 1)。

表 1

表 1 鉴定blaNDM-1基因引物 引物名称 引物序列 产物大小 EC-NDM-F 5′-GTCTGGCAGCACACTTCCTA-3′ 515 bp EC-NDM-R 5′-TAGTGCTCAGTGTCGGCATC-3′ rRNA515-F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′ 877 bp rRNA1391-R 5′-GACGGGCGGTGWGTRCA-3′

表 1 鉴定blaNDM-1基因引物

对分离出的株菌进行粗制模板的制备，步操如下：无菌条件下取100 μL 菌液放入 1.5 mL 离心管，12 000 r/min离心1 min，收集菌体，100 μL 无菌水重悬，煮沸 5 min，12 000 r/min 离心1 min，吸取上清至干净的EP管中即为粗制的PCR反应模板。对粗制模板进行blaNDM-1基因PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，以95 ℃变性30 s,55 ℃退火复性30 s，72 ℃延伸30 s进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物取5 μL与1 μL 6×loading buffer充分混合以后，点入1%琼脂糖凝胶上样孔中，在电泳仪上以150 V条件电泳30 min，电泳结束后在凝胶成像仪上观察结果，鉴定是否有条带以及条带的特异性。PCR产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序，测序结果通过EditSeq软件进行比对。

使用Sensititre Trek Diagnostic Systems 96孔板自动检测抗菌药物系统，可以精确剂量为相应的面板稀释液，相当于传统微量肉汤稀释方法。采用CLSI(美国临床和实验室标准协会)推荐改良的微量肉汤稀释2~8点，在每一反应孔内参与荧光底物，若细菌生长，表面特异酶系统水解荧光底物，激发荧光，反之无荧光，检测出的荧光的量正比于细菌生长。将制备好的细菌悬液加入96孔药敏板中，每板可做2个菌，做好标记，然后放入37 ℃培养箱中，孵育18~24 h后读板。实验中所使用的Sensititre非苛养菌药敏板(96孔板)，每块药敏板都包被有适量稀释度的抗生素试剂：头孢他啶(ceftazidime,CAZ)、头孢曲松(ceftriaxone,CRO)、亚胺硫霉素(imipenem,IPM)、呋喃妥因(nitrofurantioin,NIT)、阿洛西林(azalomycin,AZL)、四环素(tetracycline,TE)、头孢吡肟(cefepime,FEP)、头孢哌酮(cefoperazone,CSL)、头孢唑啉(cefazolin,CZO)、头孢西丁(cefoxitin,FOX)、妥布霉素(tobramycin,TOB)、左氧氟沙星(levofloxacin,LVX)、庆大霉素(gentamycin,GEN)、替卡西林(ticarcilin,TLC)、替卡西林/克拉维酸(ticarcilin/clavulanic acid,TCC)、氨曲南(aztreonam,ATM)、氨苄西林(ampicillin,AMP)、氯霉素(chloromycetin,CHL)、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(trimethoprim/sulfamethoxazole,TMP/SXT)、诺氟沙星(norfloxacin,NOR)、阿米卡星(amikacin,AMK)、阳性对照、阴性对照。18 h后取出，放入Auto Reader打开SWIN软件进行读板，记录好每个板子的编号及样品编号，保存判读结果。

从医院未处理的污水中分离出的不动杆菌，用blaNDM-1基因特异性引物扩增后，电泳显示有20株为NDM-1阳性。序列分析BLAST 结果显示NDM-1完整阅读框基因与Klebsiella pneumonia pPMK1-NDM(GenBank:CP008933)基因序列同源性达到100%，未发现突变位点。

图 1

注：M：Marker；1：BJ-1；2：BJ-4；3：BJ-7；4：BJ-8；5：BJ-9；6：BJ-10；7：BJ-11；8：BJ-12；9：BJ-13；10：BJ-14；11：BJ-15；12：BJ-16；13：BJ-17；14：BJ-18；15：BJ-19；16：BJ-20；17：BJ-22；18：BJ-25；19：BJ-26；20：BJ-27。BJ(北京)。 图 1 blaNDM-1基因引物PCR产物电泳结果

经 API 20NE 生化鉴定和16S rRNA基因序列分析显示，20株 NDM-1阳性的不动杆菌中有10株菌为鲍曼不动杆菌，4 株为鲁菲不动杆菌，4 株为醋酸钙不动杆菌，2 株为琼氏不动杆菌。

表 2

表 2 NDM-1阳性不动杆菌的耐药分析(%，n=20) 抗生素 抗生素敏感性 R I S 头孢他啶 100 0 0 头孢曲松 100 0 0 亚胺硫霉素 85 15 0 呋喃妥因 45 55 0 哌拉西林 40 35 25 四环素 0 0 100 头孢吡肟 100 0 0 头孢哌酮 100 0 0 头孢唑啉 100 0 0 头孢西丁 100 0 0 妥布霉素 20 5 75 左氧氟沙星 0 5 95 庆大霉素 40 10 50 替卡西林 100 0 0 替卡西林/克拉维酸 55 0 45 氨曲南 40 55 5 氨苄西林 100 0 0 氯霉素 40 25 35 甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑 55 0 45 诺氟沙星 70 5 25 阿米卡星 0 0 100 注：R：耐药；S：敏感；I：中度敏感。

表 2 NDM-1阳性不动杆菌的耐药分析(%，n=20)

20株不动杆菌菌株的药敏模式有相似之处。所有菌株对头孢类药物，包括头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢唑啉、头孢西丁以及替卡西林和氨苄西林均表现为耐药，耐药率达到了100%；其次为亚胺硫霉素(亚胺培南)，除编号为BJ-1,BJ-4和BJ-27为中度敏感,其他菌株均对其耐药，耐药率为85%；所有菌株对四环素和阿米卡星均表现为敏感；除BJ-13,BJ-20及BJ-26外,其余菌株对氨基糖苷类均表现为敏感；对诺氟沙星的耐药率达到了70%；有55%的菌株对甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑表现出了耐药性，而BJ-1,BJ-4,BJ-10,BJ-13，BJ-19和BJ-22表现为敏感。但是对氨基糖苷类(庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星)、喹诺酮类(左氧氟沙星、诺氟沙星)及单环酰胺类(氨曲南)表现出的药敏表型有明显的差异,推测可能与菌株所携带的耐药基因不同有关。 3 讨 论

本菌可引起伤口及皮肤感染、呼吸道和泌尿生殖道感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎等，重症者可导致死亡。不动杆菌属可分为7种，即醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)、鲁菲不动杆菌(A.lwoffi)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、溶血不动杆菌(A.haemolytius)、琼氏不动杆菌(A.junii)、约翰逊不动杆菌(A.johnsonii)和抗辐射不动杆菌。其中鲍曼不动杆菌对湿热、紫外线、化学消毒剂有较强抵抗力，广泛分布于医院环境中，各种医疗器具和医务人员手的检出率均很高。近年来随着临床上广谱抗生素的大量应用，出现了对大部分抗生素耐药的多重耐药及超耐药鲍曼不动杆菌，并时常造成医院感染的暴发流行，给临床治疗带来极大困难，被誉为 21 世纪革兰阴性菌中的“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌”(MRSA)^[1]。不动杆菌属的侵袭力及致病力比不上肠杆菌科细菌,但是该菌属细菌对抗菌药物的耐药性威胁较其他菌属则高出许多^[7]。有数据显示在印度、英国、瑞典等国家，检出的产NDM酶肠杆菌科细菌占所检测细菌的1.2%~13%,主要菌种为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,其他细菌还有阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸櫞酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌及铜绿假单胞菌等^{[8, 9, 10]}；而在中国从大量的数据中可以看出blaNDM-1基因阳性菌以不动杆菌属为主。Yang等^[11]从ICU分离的3 114株不动杆菌属中筛查出24株携带有blaNDM-1基因的A.pittii；俞云松等^{[12, 13]}学者从2009年1月—2010年9月间收集的来自全国18个省市,57家医院的革兰阴性杆菌12 024 株(其中大肠埃希菌3439株、肺炎克雷伯菌2 840株、不动杆菌属2 835株以及铜绿假单胞菌2 910株)筛查到13株blaNDM-1阳性不动杆菌。在本研究中，在对医院的污水进行细菌分离鉴定之后，可以确定在20株NDM-1阳性菌中有10株为鲍曼不动杆菌，由此可见耐药的鲍曼不动杆菌检出率较高。在医院的污水中有多种菌属共存，与耐药不动杆菌混合，有获得耐药基因的可能性。在医院里的患者接触这些携带blaNDM-1基因的菌种的机会多，直接或者间接由不动杆菌引起的耐药菌院内感染发生的可能性随之增加。医院的污水为各个菌属之间获得耐药基因提供了一个有利场所，若不进行严格管控，容易造成多重耐药不动杆菌在院内的暴发流行，给治疗带来极大的困难。

多重耐药不动杆菌,尤其是碳青霉稀类耐药不动杆菌已经呈现全球流行的趋势：2001—2004年，SENTRY抗菌药物监测数据表明当时欧洲、拉丁美洲和亚太地区分离的不动杆菌对亚胺培南的总体敏感率有81.1%^[14],而这一比例在2006年已经下降到65.8%，到了2009年仅仅有40.2%比率的不动杆菌还对亚胺培南保持敏感性^[15]。本研究中分离出的20株NDM-1阳性菌均对亚胺培南产生了不同程度的耐药，耐药率已经达到了85%，可以推测不动杆菌对亚胺培南的耐药性正在不断的提高。并且这些菌对头孢类药物和替卡西林也都表现出了较强的耐药性，在本研究中对其产生的耐药率也达到了100%，而这些药物是现在临床上比较常用的抗菌药物，一旦发生院内感染，将给治疗带来极大的困难。因此，对医院污水的妥善处理应该引起重视，否则将很可能为耐药菌株在医院内暴发流行创造条件。