大豆异黄酮(soybean isflavones，SIF)是大豆等豆科植物生长过程中形成的一类次生代谢物，是生物黄酮中的一种^[1]，作为典型的植物雌激素，具有抗氧化、降低胆固醇及保护心血管系统作用，并有预防骨质疏松，防癌抗癌和神经保护作用，受到国内外广泛的关注^[2]。研究表明，给予幼鼠大豆异黄酮干预后，卵巢重量减轻，闭锁卵泡比例上升，成熟卵泡数减少^[3]。大豆异黄酮影响卵巢发育机制可能与大豆异黄酮在体内发挥雌激素/抗雌激素样作用，抑制卵巢的正常生长有关，但大豆异黄酮的雌激素样活性很弱，其生物活性仅为雌二醇的1/1 000~1/10 000。鉴于大豆异黄酮属于多酚类化合物，具有与金属离子发生螯合作用的特性，故推测大豆异黄酮可能通过螯合钙、铁、锌等金属元素进而影响卵巢的正常发育。为此，本研究采用刚断乳雌性小鼠为实验动物，旨在探讨大豆异黄酮对幼鼠卵巢发育影响及机制，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验动物

刚断乳雌性imprinting control region(ICR)小鼠40只，体重(15±2)g，由上海斯莱克实验动物中心提供，许可证号：SCXK(沪)2012—0002，饲养环境为(22±2)℃，湿度为(50±20)%，置于垫以消毒锯木屑的塑料笼，自由饮水进食。 1.2 主要试剂与仪器

大豆异黄酮(郑州荔诺生物科技有限公司)；钙、铁、锌标准品(国家钢铁材料测试中心冶金部钢铁研究总院)；高氯酸、硝酸(优级纯，衡阳市凯信化工试剂有限公司)；伊红(福州迈新生物技术开发有限公司)；BH-2 型光学显微镜(日本Olympus公司)；TAS-986原子吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。 1.3 动物分组与处理

40只ICR小鼠随机分为4组，即对照组，低、中、高剂量大豆异黄酮组(50、100、200 mg/kg)，对照组给予等量蒸馏水，每日灌胃1次，灌胃容量10 mL/kg，连续5周，每日观察小鼠活动及称量体重，干预结束后观察小鼠动情周期2周；禁食12 h称重，眼球取血，分离血清待测；颈椎脱臼法处死小鼠，尽可能剔除卵巢周边结缔组织和脂肪组织，在生理盐水中漂洗，用滤纸吸干，电子天平称重，-80 ℃保存待测。 1.4 指标与方法

隔天称重1次。体重记录至实验结束；记录小鼠处死前体重及双侧卵巢湿重，计算卵巢系数(mg/g)=卵巢重量(mg)/小鼠体重(g)；干预结束后每天早8时和晚20时行小鼠阴道涂片，观察各组小鼠动情周期情况，判断标准：动情前期：可见大量脱落的有核上皮细胞(多呈卵圆型)；动情期：可见很多大而扁平、边缘不整齐的无核角化鳞状细胞，没有白细胞及上皮细胞；动情后期：角化上皮细胞减少，并出现有核上皮细胞和白细胞；动情间期：有白细胞及粘液。强酸消化(硝酸：高氯酸=4：1)卵巢和血清至澄清透明，定容，采用原子吸收分光光度计测定卵巢和血清中的钙、铁、锌含量(标准曲线法)。 1.5 统计分析

数据采用x±s表示，采用SPSS 19.0软件包进行数据分析。定量数据采用单因素方差分析；各组间两两比较采用q检验，检验水准为α=0.05。 2 结果 2.1 大豆异黄酮对小鼠体重及卵巢系数影响(表1)

表 1

表 1 大豆异黄酮对小鼠体重、卵巢重量及系数影响(x±s，n=10) 组别(mg/kg) 体重(g) 双侧卵巢重(mg) 脏器系数(mg/g) 对照组 23.46±1.94 26.4±9.9 1.135±0.468 大豆异黄酮50 22.74±1.80 21.7±10.9 0.951±0.492                     100 23.77±1.41 22.1±4.6 0.934±0.231                     200 24.06±1.64 17.8±4.5a 0.746±0.213a 注：与对照组比较，a P＜0.05。

表 1 大豆异黄酮对小鼠体重、卵巢重量及系数影响(x±s，n=10)

观察期间各组小鼠毛色有光泽、进食饮水、粪便、尿液均未见异常。与对照组比较，各剂量大豆异黄酮组小鼠体重无明显变化；与对照组比较，高剂量大豆异黄酮组小鼠双侧卵巢重量及卵巢系数均降低，差异有统计学意义(F=3.664、3.567，P < 0.05)。 2.2 大豆异黄酮对小鼠动情周期影响(表2)

表 2

表 2 大豆异黄酮对小鼠动情周期影响(h，x±s，n=10) 组别(mg/kg) 动情前期 动情期 动情后期 动情间期 总时长 对照组 19.6±6.38 34.0±3.40 19.2±3.16 42.4±6.02 115.2±4.14 大豆异黄酮50 18.4±3.37 29.2±6.55 20.0±4.62 42.9±5.54 110.5±4.87                     100 19.6±3.50 32.4±5.80 19.8±4.64 45.2±2.72 117.0±3.89                     200 18.0±4.71 28.8±5.27 21.2±3.80 44.0±3.71 112.0±4.12

表 2 大豆异黄酮对小鼠动情周期影响(h，x±s，n=10)

与对照组比较，各剂量大豆异黄酮组小鼠动情前期、动情期、动情后期、动情间期及周期总时长均无明显变化(F=1.321、1.834、1.643、1.587、1.867,均P>0.05)。 2.3 大豆异黄酮对小鼠卵巢及血清钙、铁、锌含量影响(表3)

表 3

表 3 大豆异黄酮对小鼠卵巢及血清钙、铁、锌含量影响(x±s，n=10) 组别(mg/kg) 卵巢 血清 钙(mg/g) 铁(mg/g) 锌(mg/g) 钙(μg/mL) 铁(μg/mL) 锌(μg/mL) 对照组 2.422±0.558 1.209±0.301 0.202±0.049 106.184±41.669 56.250±12.853 2.039±0.714 大豆异黄酮50 1.038±0.313a 1.673±0.314a 0.118±0.066a 87.689±17.002 52.904±7.118 2.844±1.225                   100 1.327±0.275a 0.776±0.177a 0.143±0.052a 103.623±52.585 52.234±18.518 3.570±0.697a                   200 1.601±0.598a 0.770±0.138a 0.137±0.023a 112.265±41.073 53.101±10.472 4.954±1.448a 注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 3 大豆异黄酮对小鼠卵巢及血清钙、铁、锌含量影响(x±s，n=10)

与对照组比较，各剂量大豆异黄酮组小鼠卵巢钙、锌含量均降低，差异具有统计学意义(F=13.511、12.150,均P < 0.05)；与对照组比较，低剂量大豆异黄酮组小鼠卵巢铁含量上升，而中、高剂量组小鼠卵巢铁含量下降，差异有统计学意义(F=7.677,P < 0.05)；与对照组比较，各剂量大豆异黄酮组小鼠血清钙、铁含量无明显变化(F=0.543、0.154,均P>0.05)，中、高剂量大豆异黄酮组小鼠血清锌含量上升(F=5.346,P < 0.05)。 3 讨 论

本研究结果显示，高剂量大豆异黄酮组雌性小鼠卵巢重量及卵巢系数明显低于对照组，提示卵巢发育受到明显影响，与前期研究结果一致^[3]；大豆异黄酮各剂量组小鼠动情周期并未产生明显变化，提示大豆异黄酮的雌激素样活性很弱。钙元素对维持人体的生长发育与新陈代谢、细胞分裂、酶类激活、内分泌活动等具有重要作用，对卵巢生长发育具有促进作用。Arjmandi等^[4]通过实验推测大豆异黄酮可能作为雌激素受体选择性调节剂(SERM)结合不同细胞的雌激素受体，通过调节维生素D影响钙的吸收。研究表明，补充茶多酚可明显提高力竭运动后心肌组织中超氧化岐化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、总抗氧化活力、钙离子ATP酶(Ca²⁺-ATP)和钠钾离子ATP酶活性，有效阻抑丙二醛和Ca含量的升高^[5]。大豆异黄酮与茶多酚同属于黄酮类化合物，而且具有相同的-OH，故本研究中卵巢钙含量明显下降可能与大豆异黄酮抑制Ca²⁺-ATP酶等相关通道阻止钙元素进入卵巢组织有关，具体机制有待进一步研究。

研究表明黄酮类化合物是一种强Fe³⁺螯合剂^{[6, 7, 8]}。铁是构成血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素以及某些呼吸链的组成成分，参与体内氧的运输和组织呼吸过程，维持正常的氧供是卵巢正常生长发育所必须的。本研究结果显示，与对照组比较，低剂量大豆异黄酮组小鼠卵巢铁含量明显升高，可能与机体摄入的大豆异黄酮在卵巢中螯合Fe³⁺，使卵巢组织中铁含量升高有关。而过量的铁可促进组织的过氧化损伤^[9]。锌参与促黄体激素、促卵泡激素、促性腺激素、胰岛素等内分泌激素的代谢，对胎儿生长发育、促进性器官和性机能发育均具有重要调节作用^[10]。刘晶莹等^[11]采用纯度为28.3%的大豆异黄酮，在保持一定的锌离子浓度条件下，当大豆异黄酮的量增加时，锌的螯合量逐渐升高。本研究结果表明，大豆异黄酮各剂量组小鼠卵巢锌含量明显降低，而血清中锌含量明显升高。可能与大豆异黄酮在血液中与锌发生螯合作用，从而使血锌水平升高，并影响锌向卵巢组织分布，其具体机制有待进一步研究。