砷是确认的人类致癌物，在自然界广泛分布于水、土壤和空气中。全世界约有20多个国家发现有地方性砷中毒病区或者高砷区存在，约有2亿人因长期饮用高砷水而面临健康威胁。我国属于亚洲病区分布较广泛的国家之一。到目前为止，我国受饮水型砷暴露威胁的人群已超过300万^[1]。饮水型地方性砷中毒是严重危害我国人群健康的地方病，生活饮用水是砷进入人体内的主要途径，饮水中所含的砷主要为无机砷(inorganic arsenic，iAs)，进入机体内的砷主要在肝脏进行甲基化代谢，然后通过尿液排出体外。大量流行病学研究表明，影响机体内砷代谢的主要因素除了年龄、性别和暴露砷水平以外，还受环境因素(如吸烟、饮酒、膳食因素等)的影响。另外，在相同砷暴露条件下，同一地区人群中的不同个体之间甚至同一家庭不同成员之间，砷的代谢能力及砷中毒发病情况也存在一定的差异。这就提示遗传因素对砷的甲基化代谢能力及发病风险也有一定影响。 1 无机砷甲基化代谢过程及砷代谢产物毒性 1.1 无机砷甲基化代谢过程

到目前为止，砷在机体内的代谢主要存在两种假设。一种是砷的经典途径，认为五价无机砷(iAs⁵⁺)进入体内被谷胱甘肽(glutathione,GSH)还原成三价无机砷(iAs³⁺)，从甲基供体S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methionione,SAM)获得甲基，iAs³⁺被氧化甲基化生成五价一甲基砷(pentavalent monomethylated arsenic,MMA⁵⁺)，MMA⁵⁺被还原成三价一甲基砷(MMA³⁺)，MMA³⁺进一步被氧化甲基化生成五价二甲基砷(pentavalent dimethylarsine,DMA⁵⁺)，DMA⁵⁺又在GSH的作用下还原生成三价二甲基砷(DMA³⁺)，DMA³⁺为最终产物^[2]。另一种是新的砷代谢模式学说认为，iAs进入机体后，先由iAs5+还原成iAs³⁺，iAs³⁺与某些蛋白质结合，生成砷-蛋白复合物，或者与GSH结合，生成三谷胱甘肽砷复合物(arsine triglutathione,ATG)，然后发生甲基化作用，两个代谢终产物分别为MMA⁵⁺和DMA⁵⁺。这两种代谢途径都涉及砷甲基化，其甲基供体SAM均需通过一碳单位代谢生成并且都需要消耗谷胱甘肽^[3]。 1.2 无机砷代谢产物的毒性

目前科学研究中广泛采用尿砷作为评价近期砷暴露的指标。尿液是人体摄入砷的主要排泄途径，每日摄入机体内的砷约有60%~70%直接排泄在尿中^[4]，所以尿中砷的种类和含量已被公认是研究人体砷代谢模式的重要指标。尿中砷的各种代谢物(iAs、MMA、DMA) 及尿总砷(total arsenic，tAs)的水平反映了砷在机体内进行甲基化代谢的情况。砷暴露人群尿中各砷化物的水平分别为10%~30% iAs，10%~20% MMA和60%~80% DMA，但个体与个体之间也存在较大的差异^[5]。

以前的一些研究认为，无机砷(iAs⁵⁺、iAs³⁺)的毒性比有机砷(MMA、DMA、甜菜碱、砷胆碱和砷糖)要大，故认为砷甲基化代谢过程是减毒反应。然而，后续的一些研究已经证明有机砷的一些确定类型，比如中间代谢物MMA³⁺比iAs³⁺的毒性更大。因此，无机砷在机体内的甲基化代谢过程并不是一个完全解毒的过程。 2 影响砷甲基化代谢与发病风险的个体因素及环境因素

影响砷在机体内代谢的因素很多，年龄、性别、砷暴露水平^{[6, 7]}、是否吸烟、是否饮酒及营养状况等均可能是影响因素。有研究发现，在暴露于相同浓度的饮水砷条件下，儿童的二甲基化率高于成年人^[8]；Tseng等认为儿童在暴露于砷的条件下，其砷的代谢能力与成年人是不同的^[9]。对台湾饮水砷暴露人群进行的一项研究显示，女性甲基化能力显著高于男性^[10]。另一项来自于孟加拉饮水砷暴露人群的研究，并没有发现性别对机体内砷甲基化代谢能力有影响^[7]。对于我国内陆内蒙古饮水砷暴露人群进行的研究也没有发现性别对砷甲基化能力有影响^[11]。来自我国山西省饮水型砷暴露人群的研究表明，水砷暴露水平与砷中毒的皮肤病变存在关联性且水砷暴露水平越高，皮肤病变程度越严重^[12]。也有研究认为吸烟、饮酒等生活方式也可能影响砷的甲基化代谢过程^{[9, 10, 11, 12, 13]}。Megan等认为，砷的甲基化和排泄受营养物质，特别是叶酸的影响^[14]。叶酸是一碳单位环路的重要循环底物四氢叶酸的直接来源，而叶酸在人体内不能合成，仅靠饮食来源。同时，叶酸也是人体不可缺少的营养元素，主要的生理功能是作为辅酶参与嘌呤和胸腺嘧啶的合成，进一步参与DNA合成和甲基化反应，同时也参与氨基酸的代谢，在氨基酸相互转换过程中充当一碳单位的载体。叶酸的缺乏可影响细胞内核酸、蛋白质和氨基酸的代谢，干扰DNA甲基化及阻碍DNA的生物合成，参与肿瘤等相关疾病的发生过程。但叶酸并不能直接被机体利用，必须经过一系列的代谢活化才可以发挥其作用。在孟加拉的一项人群流行病学调查发现，砷暴露人群尿中的DMA%与血清叶酸水平呈正相关，而iAs%、MMA%均与叶酸水平呈负相关，提示叶酸影响砷的甲基化代谢作用^[15]。因此，观察叶酸在砷甲基化过程中的作用，探讨叶酸对砷毒性的影响，为砷暴露人群提供降低砷中毒发病风险的防护措施。 3 影响砷甲基化代谢及发病风险的遗传因素

相关研究显示，暴露于相同水平砷条件下的人群，并不是所有接触砷的人都患砷相关疾病^[16]。这就意味着除了该因素以外，遗传因素很可能对机体内砷甲基化代谢过程有影响。

目前认为，地方性砷中毒是环境因素与遗传因素共同作用的结果，除受砷暴露水平、年龄、性别、是否吸烟、饮酒等因素影响外，对砷中毒易感性的不同主要是由于不同个体对砷生物转化能力的差异，以及与砷甲基化代谢相关酶的基因多态性造成的^{[17, 18]}。大量研究显示，在砷甲基化代谢过程中，主要有2种酶直接参与五价砷的还原，即嘌呤核苷酸磷酸化酶(purine-nueleoside phosphorylase,PNP)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GST)。此外，一碳单位代谢相关酶类也间接参与砷甲基化代谢过程。 3.1 嘌呤核苷酸磷酸化酶

Purine nucleoside phosphrylase(PNP)来自肝窦内皮细胞，其基因位于染色体14q11.2上，是嘌呤补救途径中的一种酶，广泛存在于真核和原核生物中^[19]。机体内的PNP主要作用是可逆地催化嘌呤核苷磷酸的分解反应，将底物嘌呤核苷分解生成相应的嘌呤碱及核糖-1-磷酸。PNP缺乏为常染色体隐性遗传疾病，主要表现为以T细胞功能障碍为主的免疫缺乏症^[20]。Waalkes等研究发现，PNP是广泛存在于体内的砷酸盐还原酶^{[21, 22]}，在砷代谢过程中起着重要的作用，能够把机体内的iAs⁵⁺还原成iAs³⁺，是无机砷酸盐代谢的第一步，而且对无机砷排出体外及其毒性作用至关重要，直接影响后续的砷的代谢过程。不同地区、不同种族人群PNP可有多个多态位点。有研究认为，PNP基因的变异会增加个体对砷所诱导的皮肤损伤的易感性^[23]。但也有研究提示PNP的多态性对iAs⁵⁺还原成iAs³⁺的代谢过程无显著影响^[24]； PNP多态性与尿砷代谢物之间也没有明显的联系^[25]。目前，PNP多态性对砷甲基化代谢影响的研究结果不完全一致，因此，关于PNP对机体内砷甲基化代谢过程中的影响作用以及该基因多态性与砷中毒易感性是否相关，仍需进一步大量的研究。 3.2 谷胱甘肽S-转移酶

Glutathione S-transferase(GST)属于Ⅱ相反应代谢的超家族酶系，广泛分布于各种生物体内，能催化谷胱甘肽与亲电子底物的结合反应，依靠谷胱甘肽结合反应参与多种内源性和外源性化合物的生物转化代谢过程。GST在机体内对多种药物、致癌物质和多种内源性化合物的解毒过程中起到重要作用。此外，GST具有抗氧化作用，能够对抗细胞氧化应激损伤。大量研究表明，GST的遗传变异是导致多种癌症发生的危险因素。 3.2.1 GST的分类

GST在人体多个重要组织器官内广泛分布，主要存在于肝脏中，少量分布于肾脏、卵巢、睾丸、小肠、肺部等组织中。根据其超家族各成员的结构、动力学行为等因素，将GST分为7个不同的家族，各家族又分为不同的亚型，具体分类及基因定位见表 1。

表 1

表 1 人类的GST超家族分类 GST类型 GST亚型 基因定位 GST-α GSTA1、 A2 6p12 GST-μ GSTM1、M2、M3、M4、M5 1p13.3 GST-π GSTP1 11q13 GST-θ GSTT1、T2 22q11.2 GST-σ GSTS1 4q21.22 GST-ω GSTO1、GSTO2 10q25.1 GST-ζ GSTZ 14q24.3

表 1 人类的GST超家族分类

目前认为，GST家族中与砷甲基化代谢及砷中毒发病风险相关的酶主要是glutathione S-transferase M1(GSTM1)、glutathione S-transferase theta 1(GSTT1)、glutathione S-transferase P 1(GSTP1)、glutathione S-transferase omega 1(GSTO1)和glutathione S-transferase omega 2(GSTO2)^{[26, 27, 28, 29, 30]}。

GSTM1位于人类染色体1p13.3上，基因多态性有两种，分为空白基因型[GSTM1(-)]和非空白基因型[GSTM(+)]。对印度高水砷暴露地区人群开展的一项病例-对照研究发现，有皮肤损害的病例组GSTM1非空白率高于无皮肤损害的对照组，表明GSTM1(+)个体发生砷性皮肤损伤的危险性更高(OR=1.73，95%CI 为 1.24~2.22)，提示携带GSTM1(+)基因对砷暴露人群是危险因素^[31]。

GSTT1位于人类染色体22q11.23上，基因多态性有两种，分为空白基因型[GSTT1(-)]和非空白基因型[GSTT1(+)]。Cotton等研究显示，GSTT1空白型基因的分布具有明显的地区与种族差异，在非洲人群的分布频率为15%~26%、亚洲为16%~64%、欧洲为10%~21%^[32]。而GSTT1基因纯合缺失型在中国人群的分布频率为46.8%^[33]。 对孟加拉国饮水型砷中毒病区人群进行的一项病例-对照研究发现，携带GSTT1(+)基因的个体与携带GSTT1(-)基因的个体相比，患砷中毒的危险性更大^[34]。但同时也有研究表明，GSTT1(+)可能是燃煤型砷中毒的保护因素^[35]。有研究显示，GSTT1和GSTM1基因的缺失均可使GST酶的活性下降，使机体对有毒化学物质的代谢作用产生影响^[36]。Tetsuro等对越南人群进行研究，发现GSTT1 基因多态性与尿砷、发砷的浓度及砷的种类没有联系^[37]。

GSTP1位于人类染色体11q13上，基因多态性有两种，位于染色体外显子5第105位点和外显子6第114位点，分别有A转换成G，最终导致异亮氨酸(Ile)转变成缬氨酸(Val)和C转换成T，最终导致丙氨酸(Ala)转变成缬氨酸(Val)。Tetsuro等研究表明，GSTP1 Ile105Val 的突变可能会导致五价砷还原酶的活性降低，影响机体内砷的代谢^[37]。

Omega型的GST(GSTO)是近年来发现的GST家族的一个新亚型，同其他哺乳动物相比，人类GSTO基因在其活性位点具有半胱氨酸残基而不是酪氨酸或丝氨酸残基^[38]，同时GSTO在N端还有19位氨基酸的延伸片段^[39]。GSTO具有硫醇转移酶、脱氢抗坏血酸并且具有还原所有五价砷(iAs⁵⁺、MMA⁵⁺、DMA⁵⁺)的作用，而GST超家族的其他成员本质上不具有这些特性^[40]。在砷甲基化代谢过程中，MMA⁵⁺或DMA⁵⁺在GSTO1及GSTO2的催化下生成MMA³⁺或DMA3+的过程是砷甲基化代谢的关键限速过程^{[41, 42]}。

GSTO1和GSTO2位于人类染色体10q25.1上，相隔7.5kb，都具有6个外显子，长度分别为12.5kb和24.5kb^[43]。GSTO1和GSTO2的氨基酸有64%是一样的^[44]，但是GSTO2减少DMA⁵⁺的活性明显低于GSTO1^[45]。已有研究表明人类GSTO1与肝脏中的一甲基砷还原酶的特性几乎一致^[46]，这意味着该酶在砷的甲基化代谢过程中起着很重要的作用。

到目前为止，GSTO比较确定的基因多态位点主要有GSTO1 Ala140Asp、GSTO1 Glu208Lys、GSTO1 Ala236Val、GSTO1 Glu155del、GSTO1 Thr217Asn和GSTO2 Asn142Asp。GSTO基因与砷甲基化代谢的关系也是目前的研究热点，这些酶的基因位点是否发生了突变很可能对砷在机体内的甲基化代谢水平有影响，从而引起某些特定的砷相关疾病的发生^[46]。

有研究报道，通过人群研究和体外实验发现GSTO1和GSTO2的基因多态性与砷甲基化代谢相关^{[47, 48]}。对不同的人群研究结果显示，GSTO1基因多态性有明显的差异，GSTO1的Ala140Asp的等位基因在欧洲后裔的携带率是34%，但Ala140Asp的等位基因在美国人中的携带率是0%^[48]。目前，GSTO1的Ala140Asp的基因多态性被广泛研究，认为其与砷暴露人群的癌症前期的皮肤损伤以及皮肤癌的发生相关^{[47, 48, 49]}。Tanaka-Kagawa等检测了人类GSTO 1-1基因的两个多态性位点Ala140Asp和Thr217Asn，发现Ala140Asp和Thr217Asn巯基转移酶活性与野生型相比，分别下降了75%和40%，同时检测了Ala140Asp对MMA⁵⁺的还原能力以及Thr217Asn对MMA⁵⁺还原能力的差异，发现Ala140Asp的变异型与野生型具有相似的动力学效应，即还原能力不变，而Thr217Asn的变异型的酶促反应的最大速度(Vmax)和米氏常数(Km)与野生型相比，均有所下降，进一步说明了酶发生突变后，其活性也发生相应的改变，从而影响了细胞内巯基的状态及砷生物转化^[50]。而Board研究发现，GSTO1的Ala140Asp位点的杂合及纯和突变型酶结构与野生型酶结构相比发生了显著变化，酶活力也有所下降^[51]。Tetsuro等对越南砷暴露人群进行研究发现，GSTO1 Glu155del能影响砷代谢^[37]。也有研究显示，没有发现GSTO1的基因变异与砷的代谢具有相关性^{[3, 6, 46]}，GSTO1和GSTO2基因多态性与个体砷代谢的变化或者对砷的易感性不相关^[52]。出现以上不同的研究结果，可能与研究对象的样本量、所在的地区以及种族等因素有关。因此，对于GSTO的基因多态性与砷中毒易感性是否具有相关性，有待于大样本人群调查研究来进一步证实。 4 小 结

综上所述，砷甲基化代谢相关酶的多态性以及暴露砷水平、年龄、性别、是否吸烟、饮酒以及膳食营养等因素都可能对砷中毒的发生产生很大的影响。由于不同学者的研究结果不尽相同，因此对影响砷甲基化代谢以及砷中毒发病风险的相关因素仍有待进一步研究。研究结果有助于发现砷暴露易感人群，并通过指导饮食或生活行为等方式，来降低砷中毒发病风险，进而提高砷暴露人群的生命质量。