随着现代检测要求的不断提高，人们逐渐发现传统的食品中微生物的检测方法往往存在检测周期长、工作量大、所需试剂多以及灵敏性低或特异性较差等缺点^{[1, 2]}，而试剂盒方法则由于其使用方便、操作简单、出具结果更加快速等优点^{[2, 3]}，越来越为检验工作人员所接受。但实验室在拟用这些试剂盒之前，应对其进行严格评价或确认^[4]。目前，国际上常用的评价方法主要由国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO)、美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)、食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)等机构制定，由于ISO方法的规定较为全面细致，故选用《ISO 16140 ：2003》^[5]对拟用的试剂盒进行评价和确认。本研究以ISO方法为理论基础，以3M 公司的Petrifilm大肠埃希氏菌检测试剂盒(Petrifilm E.Coli Count Plates，PEC)与经典国标方法相比较作为实例，对食品中微生物检测用试剂盒的评价方法及其应用进行研究，旨在建立实用可行的食品微生物检测试剂盒的评价方法。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 菌株

大肠埃希菌标准菌株和分离株共计50株，其中标准菌株6株，2株来自于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)(北京陆桥技术有限责任公司代理)，4株来自中国医学微生物菌种保藏管理中心(China Medical Culture Collection Center，CMCC)；分离株44株，均为北京出入境检验检疫局技术中心自行分离。非目标菌株 20株，包括蜡样芽孢杆菌1株、溶血性链球菌2株、金黄色葡萄球菌1株、粪肠球菌1株、铜绿假单胞菌1株、沙门氏菌2株、副溶血性弧菌1株、李斯特氏菌7株、志贺氏菌2株、小肠结肠炎耶尔森氏菌1株、非O1非O139群霍乱弧菌1株，其中11株来自于ATCC，7株来自于CMCC，1株来自于中国普通微生物保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，北京出入境检验检疫局技术中心自行分离1株。 1.1.2 样品

本研究选取具有代表性的五大类共15种食品，分别进行添加实验和实际样品实验，所有样品均购自北京市市区的2家超级市场。其中添加实验样品为火腿(肉制品)、多春鱼(海产品)、奶粉(乳制品)、麦片(杂品)和鸡肉(家禽)，每种各取5份，别做高、中、低3个水平的添加；实际样品为猪肉馅和牛肉馅(肉制品)、多春鱼和墨斗鱼(海产品)、酸奶和奶酪片(乳制品)、花椒和小米面(杂品)和鸡心和烤鸭(家禽)，每种各取3份。 1.1.3 培养基和试剂

磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钾配制，调解pH值到7.2，北京化工厂)；营养肉汤(NB)、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷琼脂(VRBA-MUG)，均购自北京陆桥技术有限责任公司；PEC测试片(美国3M公司)。 1.2 仪器与设备

MLS-3750 压力蒸汽灭菌锅(日本三洋电机有限公司);CLASSII A2型生物安全柜 (美国LABCONCO公司);HPP 260 恒温培养箱[(36±5)℃,德国美墨尔特贸易有限公司];THZ-C-1 全温震荡器 (江苏太仓市实验设备厂);STOMACHER 400 拍击式均质器 (英国SEWARD公司);MS3 digital 漩涡混合器 (德国IKA公司)； TE612-2 天平(精确度 0.01 g，德国赛多利斯集团)；MDF-U32V超低温冰箱(-70℃，日本三洋电机有限公司)。 1.3 方法 1.3.1 传统测试法

按照国家标准《GB 4789.38-2012食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数》^[6]第二法进行检测,无菌操作取25 g样品于无菌过滤袋中,加入225 mL磷酸盐缓冲液,拍击均质,制成1:10的样品匀液,然后依次制成10倍递增稀释的样品匀液,选取2~3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。10~15 mL 冷至(45±0.5)℃的VRBA倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3~4 mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 ℃培养24 h。 1.3.2 PEC法

无菌操作取25 g样品于无菌过滤袋中,加入225 mL磷酸盐缓冲液,拍击均质,制成1:10的样品匀液,然后依次制成10倍递增稀释的样品匀液,选取2~3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个测试片，吸取合适梯度的食品样品稀释液1 mL，垂直滴加在掀开上层膜的测试片的中央处，小心地盖好上膜，防止产生气泡，将测试片的透明面向上，36 ℃培养48 h。 1.3.3 特异性实验

选取20株经viteke确认的远源菌接种PEC测试片，观察菌落形态从而确定测试片针对非目标菌的特异性；选取确认为大肠埃希菌标准菌株及经viteke确证的分离株共50株接种PEC测试片，观察菌落形态，从而确定测试片针对目标菌的特异性。 1.3.4 添加实验

从大肠埃希菌(ATCC 25922)标准菌株的斜面上，挑取1环菌落接种于50 mL营养肉汤中，于36 ℃摇动培养过夜(14~18 h)，得到细菌培养原液。将培养原液用磷酸盐缓冲液分别稀释到低水平(10~100 CFU/mL)、中水平 (100~1 000 CFU/mL)、高水平(1 000~10 000 CFU/mL)3个水平。将制好的3个水平的菌液添加到选取的五类样品(火腿、多春鱼、奶粉、麦片、鸡肉)中，每类样品重复试验5次。分别采用国标法与PEC法对此75组样品进行大肠埃希氏菌的测定，比较2种方法之间是否有差异，确定2种实验的灵敏度。 1.3.5 耐变性实验

选取高和低2个污染水平的大肠埃希氏菌(ATCC 25922)分别于35和37 ℃、18和24 h的不同条件下培养，以确定测试片的耐变性。 1.3.6 实际样品检测

选取多春鱼、鸡心、猪肉馅、花椒、墨斗鱼、烤鸭、牛肉馅、酸奶、奶酪片、小米面共10种30组自然样品，分别采用国标法和PEC测定，比较2种方法之间是否有差异。 1.4 统计分析

应用Graphpad Prism 5.0软件进行统计分析。应用国标法和测试片法分别对阳性添加样品和实际样品中进行检测，对2种方法均为阳性的结果进行分析。为了获得更加对称的分布，将计数结果转化成对数形式，采用转换为Log10的值比较测试片方法与国标法的一致性。 2 结 果 2.1 特异性

将20株非目标菌接种于测试片，实验结果均未见菌落生长，说明PEC法针对非目标菌特异性为100%(20/20)；选择经确认的大肠埃希菌标准菌株和分离株共50株接种于测试片，观察菌落形态，6株标准菌株和36株分离株在测试片上菌落呈现典型蓝色并伴随有明显气泡，有8株分离株呈现大肠埃希菌非典型性菌落形态，说明PEC法针对目标菌特异性为84%(42/50),非典型生长的8株菌经viteke鉴定为大肠埃希菌。 2.2 灵敏度(表 1)

将10~100 CFU/mL的菌悬液添加至5种添加实验样品中，分别应用国标法和PEC法进行测试，结果显示，PEC法和国标法对低浓度添加样品的灵敏度基本可达到10 CFU/g，在以火腿为基质时，PEC法有3项实验未检测到目标菌，而国标法则均有检出，说明国标法的灵敏度略高于PEC法。

表 1

表 1 PEC法和国标法对低浓度添加样品的测试结果 样品 基质 实验 次数 PEC法计 数值(CFU/g) 国标法计 数值(CFU/g) 火腿 1 10 10 2 10 20 3 0 30 4 0 10 5 0 10 多春鱼 1 40 10 2 20 20 3 20 20 4 10 10 5 10 10 奶粉 1 10 10 2 10 20 3 10 10 4 10 10 5 10 10 麦片 1 20 10 2 10 10 3 10 10 4 10 20 5 10 10 鸡肉 1 10 20 2 10 10 3 10 10 4 10 10 5 20 10

表 1 PEC法和国标法对低浓度添加样品的测试结果

选取高和低2个污染水平的大肠埃希菌(ATCC 25922)分别于35和37℃、18和24 h的不同条件下培养，结果显示，所有样品在35和37℃条件下与18和24h条件下检测结果分别进行t检验，差异均无统计学意义(P＞0.05)，说明Petrifilm测试片的耐变性良好。

表 2

表 2 耐变性试验结果 37 ℃培养18 h 37 ℃培养24 h 35 ℃培养18 h 35 ℃培养24 h 计数值(CFU/g) Log值 计数值(CFU/g) Log值 计数值(CFU/g) Log值 计数值(CFU/g) Log值 2 000 3.30 3 100 3.49 3 700 3.57 2 800 3.45 2 800 3.45 2 800 3.45 2 300 3.36 3 100 3.49 40 1.60 20 1.30 10 1.00 20 1.30 40 1.60 10 1.00 50 1.70 20 1.30

表 2 耐变性试验结果

应用国标法和PEC法同时检测多春鱼、鸡心、猪肉馅、花椒、墨斗鱼、烤鸭、牛肉馅、酸奶、奶酪片、小米面共10种自然样品，每种样品取3份。结果显示，PEC法检测出阳性样品4份(鸡心3份、花椒1份)，国标法检测出阳性样品6份(鸡心3份、猪肉馅1份、花椒1份、牛肉馅1份)，2种方法符合率为93.33%(28/30)；PEC法检测值大于国标法的为1份，占3.3%(1/30)；PEC法检测值小于国标法的为4份，占13.3 %(4/30)；2种方法完全相同的为25份，占83.3%(25/30)。

表 3

表 3 10种实际样品国标法和PEC法测试结果 基质 单位 国标法 PEC法 1 2 3 1 2 3 多春鱼 CFU/g <10 <10 <10 <10 <10 <10 Log10 1.00b 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 鸡心 CFU/g 320a 500a 290a 320a 420a 180a Log10 2.51 2.70 2.46 2.51 2.62 2.26 猪肉馅 CFU/g <10 <10 24a <10 <10 <10 Log10 1.00 1.00 1.38 1.00 1.00 1.00 花椒 CFU/g <10 <10 170a <10 <10 190a Log10 1.00 1.00 2.23 1.00 1.00 2.28 墨斗鱼 CFU/g <10 <10 <10 <10 <10 <10 Log10 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 烤鸭 CFU/g <10 <10 <10 <10 <10 <10 Log10 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 牛肉馅 CFU/g 22a <10 <10 <10 <10 <10 Log10 1.34 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 酸奶 CFU/g <10 <10 <10 <10 <10 <10 Log10 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 奶酪片 CFU/g <10 <10 <10 <10 <10 <10 Log10 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 小米面 CFU/g <10 <10 <10 <10 <10 <10 Log10 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 注：a 检测结果为阳性；b 为了便于计算，当菌落结果<10时，默认其Log值为1.00。

表 3 10种实际样品国标法和PEC法测试结果

应用国标法和PEC法同时检测火腿、多春鱼、奶粉、麦片、鸡肉5种添加实验样品共75份，国标法检测出阳性样品75份，PEC法检测出阳性样品72份(3份阴性样品为火腿)，2种方法符合率为96.0%(72/75)；PEC法检测值大于国标法的为13份，占17.3%(13/75)；PEC法检测值小于国标法的为47份，占62.7%(47/75)；2种方法完全相同的为15份，占20.0%(15/75)。以PEC法结果的自然对数值为因变量，国标法检测结果的自然对数值为自变量进行相关分析。结果显示，2种方法测试大肠埃希菌总的线性方程为y=0.9421x+0.328 4，相关系数为0.798 9，火腿、多春鱼、奶粉、麦片、鸡肉的相关系数分别为0.912 3、0.932 9、0.740 0、0.804 2、0.954 3。对2种方法检测出来的阳性样品测试结果进行比较，5类样品不同方法测试结果差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表 4

表 4 5种添加实验样品国标法和PEC法测试结果 样品基质 实验次数 高水平 中水平 低水平 国标法 PEC法 国标法 PEC法 国标法 PEC法 计数值 (CFU/g) log值 计数值 (CFU/g) log值 计数值 (CFU/g) log值 计数值 (CFU/g) log值 计数值 (CFU/g) log值 计数值 (CFU/g) log值 火腿 1 1 800 3.26 600 2.78 120 2.08 130 2.11 10 1.00 10 1.00 2 1 200 3.08 400 2.60 220 2.34 110 2.04 20 1.30 10 1.00 3 1 400 3.15 1 000 3.00 160 2.20 60 1.78 30 1.48 <10 1.00 4 1 400 3.15 1 000 3.00 180 2.26 80 1.90 10 1.00 <10 1.00 5 900 2.95 1 400 3.15 160 2.20 60 1.78 10 1.00 <10 1.00 多春鱼 1 1 200 3.08 1 300 3.11 120 2.08 60 1.78 10 1.00 40 1.60 2 1 200 3.08 900 2.95 130 2.11 80 1.90 20 1.30 20 1.30 3 1 100 3.04 700 2.85 100 2.00 70 1.85 20 1.30 20 1.30 4 1 600 3.20 900 2.95 120 2.08 160 2.20 10 1.00 10 1.00 5 700 2.85 400 2.60 150 2.18 90 1.95 10 1.00 10 1.00 奶粉 1 2 100 3.32 800 2.90 130 2.11 10 1.00 10 1.00 10 1.00 2 2 100 3.32 600 2.78 130 2.11 10 1.00 20 1.30 10 1.00 3 1 900 3.28 1 100 3.04 190 2.28 10 1.00 10 1.00 10 1.00 4 1 600 3.20 1 000 3.00 170 2.23 10 1.00 10 1.00 10 1.00 5 1 500 3.18 500 2.70 110 2.04 10 1.00 10 1.00 10 1.00 麦片 1 1 400 3.15 1 300 3.11 120 2.08 150 2.18 10 1.00 20 1.30 2 1 100 3.04 800 2.90 110 2.04 40 1.60 10 1.00 10 1.00 3 2 200 3.34 400 2.60 90 1.95 140 2.15 10 1.00 10 1.00 4 1 500 3.18 100 2.00 60 1.78 90 1.95 20 1.30 10 1.00 5 1 100 3.04 1 700 3.23 80 1.90 50 1.70 10 1.00 10 1.00 鸡肉 1 1 700 3.23 1 600 3.20 140 2.15 90 1.95 20 1.30 10 1.00 2 1 600 3.20 2 000 3.30 190 2.28 80 1.90 10 1.00 10 1.00 3 2 200 3.34 1 100 3.04 220 2.34 110 2.04 10 1.00 10 1.00 4 1 600 3.20 1 800 3.26 200 2.30 100 2.00 10 1.00 10 1.00 5 1 500 3.18 1 400 3.15 240 2.38 120 2.08 10 1.00 20 1.30

表 4 5种添加实验样品国标法和PEC法测试结果

在当代食品微生物检测工作中，工作人员常常需要应用商品化试剂盒，而当这些试剂盒未被批准成为相应标准的时候，均属于非标准方法。当使用这些非标准方法之前，中国实验室国家认可委员会规定，实验室必须提前进行方法的评价与确认，只有当评价与确认符合要求时，这些方法才能替代标准方法来进行检测并出具实验结果^[4]。大肠埃希菌以前一直被认为是寄生在人和动物体内的正常菌群，但机体抵抗力下降或当大肠埃希菌侵入肠外组织或器官时，则会引起感染。其引起的肠外感染，主要为化脓性感染；部分血清型的大肠埃希菌可引起肠道内感染^{[7, 8]}。由于大肠埃希菌广泛存在与人和动物的粪便中，一旦在食品中检测到此菌，则表明该食品曾直接或间接被粪便所污染。在日常的检测工作中，大肠埃希菌有着较高的检出率，有报道称，在辽宁省沈阳市零售肉类中，大肠埃希菌在鸡肉、鸭肉和兔肉中检出率为100%，猪肉中检出率为85%，牛肉中为89%^[9]。在黑龙江省哈尔滨市腹泻病致病菌监测分析，致泻大肠埃希菌为主要的病源菌^[10]，因而对于食品中大肠埃希氏菌的检测有着重要的意义。近年来，为了减少检测时间，提高检测灵敏度与精确度，许多新的方法正逐步应用于大肠埃希菌的检测中，如基于TyrFe3O4 MNPs-CNTsGCE生物传感器流动注射的安培分析法^[11]、铂纳米颗粒修饰电极的电化学法^[12]、Micro-Snap技术^[13]和LAMP法^[14]等。随着研究的深入，许多快速检测方法都已经商品化。PEC就是一种较成熟的检测大肠埃希菌的试剂盒，它含有结晶紫中性红胆盐、冷水可溶性凝胶和葡萄糖苷酶指示剂的载片，大肠埃希菌(97%)在此载片上能产生β-葡萄糖苷酶与指示剂反应，产生蓝色沉淀并产生气泡。因此，检测者可通过目测对大肠埃希菌菌落数进行定量的快速检测。本研究以ISO 16140为理论基础，以对PEC的评价为实例，从而对试剂盒评价过程进行研究。旨在建立一套实用可行的试剂盒评价方法，为食品中微生物检测用试剂盒评价方法的研究与应用积累经验。

在进行方法评价的选材方面，ISO规定需从肉制品、禽肉、海产品、水果和蔬菜奶制品、巧克力和面包食品及其他食品中选取5种不同种类的食品，每类取3个类型进行分析^[5]。本研究选取的材料为本实验室附近超市易于采购的食品，具体操作时材料可根据各实验室情况进行自主选择。在特异性检测结果中，本实验室针对目标菌得出PEC法的特异性为84%，此结果低于3M公司在其判读手册中所给出的97%的结论，这可能与本研究只选取了50株菌株进行实验有关，在今后的工作中，应进一步收集菌株，扩大实验量以进行确认。在灵敏度检测结果中，国标法的灵敏度略高于PEC法。在具体实验操作过程中，本研究发现由于国标法规定要选择菌落数在 10~100 CFU的平板，需要在暗室中360~366 nm波长紫外灯照射下计数平板上发浅蓝色荧光的菌落，使得人为因素对结果的影响较为明显；而且此方法操作起来非常费力，其蓝色荧光较难看清，尤其是生长较小的菌落，基本难以看见；且长时间注视紫外线，操作人员的眼睛也易于疲劳，不利于工作人员的防护。因此，PEC法的选择性较国标法更强，操作更简单易行，可以作为检测大肠埃希氏菌的有效替代方法。