硒是哺乳动物和人体必需的一种微量元素，以无机和有机2种化学形态存在。无机硒以硒酸盐和亚硒酸盐等形式存在，在中国的大骨节病和克山病区广泛采用的就是亚硒酸钠(sodium selenite,Na₂SeO₃)作为补硒药物。有机硒主要以硒代蛋氨酸(selenomethionine,SeMet)和硒代半胱氨酸(selenocysteine，SeCys)等形式存在于蛋白质肽链中。SeMet 和SeCys是膳食硒的主要化学形式，植物性食物中以SeMet为主，动物性食物中以SeCys为主。目前，通过同位素标记和生物信息学方法已从人类基因组中发现25种硒蛋白^[1]。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)是机体内广泛存在的一种重要硒蛋白，其活性中心是SeCys。GPx活性与硒摄入量有关，是最典型的含硒酶，其主要作用是促进氢过氧化物代谢，减少对机体的损伤。硒蛋白 P(selenoprotein P，SEPP)是一种硒转运蛋白，结合的硒含量约占体内总硒量的60%，影响全身硒平衡，其特殊性在于含有至少10个SeCys残基^[2]。本研究选取来源于人肝癌组织的HepG2细胞，利用具有高灵敏度和特异性的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法检测3种硒化合物在体外合成GPx和SEPP效应，比较不同硒化合物合成硒蛋白能力，为缺硒人群合理补硒提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

HepG2细胞(中国疾病预防控制中心营养与健康所营养与代谢研究室保存)，Na₂SeO₃(中国疾病预防控制中心营养与健康所保存)，SeMet、MeSeCys(美国Sigma-Aldrich公司)，SEPP、GPx双抗体夹心ELISA 检测试剂盒(北京安迪华泰科技有限公司)，达尔伯克必需基本培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium/nutrient mixture F-12 ham′s,DMEM/F12)、胎牛血清和胰蛋白酶(trypsin-EDTA，0.05%)(美国Gibco公司)。分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，Synergy HTX多功能酶标仪(美国Biotek公司)。 1.2 分组与处理

将培养好的HepG2细胞随机分为4组：对照组、Na₂SeO₃组、SeMet组、MeSeCys组，各组硒化合物均设低、中、高(0.01、0.10、1.00 μmol/L)3种剂量；待细胞处于对数生长期时，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次后加入新鲜培养液，同时加入配好的3种硒化合物，使其终浓度分别为0.01、0.10、1.00 μmol/L，对照组加相同体积的PBS；将细胞置37 ℃、5%CO₂孵箱中继续培养48、72 h。 1.3 指标与方法 1.3.1 样品收集

SEPP主要分泌至细胞外，而GPx位于细胞内胞浆中。用无菌管分别收集细胞培养上清液(用于检测SEPP)和裂解液(用于检测GPx)，将细胞培养上清液吸至离心管中，4 ℃离心(3 000 r/min)20 min仔细收集上清液。收集细胞内成份时，用PBS(pH 7.4)稀释细胞悬液，使细胞浓度达到10⁶个/mL左右，加入细胞裂解液或反复冻融方式，使细胞壁破坏并释放出细胞内成份，4 ℃离心(3 000 r/min)20 min收集上清。收集的样品均保存于-80 ℃，并在2周内完成检测。 1.3.2 细胞上清液中SEPP浓度检测

设置5个标准品浓度用于制作标准曲线，分别为120、80、40、20、 10 pg/mL，并设空白对照孔(空白孔不加样品及酶标试剂，其余操作同样品孔)，每组做3个复孔；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL(样品最终稀释5倍)；用封板膜封板后置37 ℃温育30 min，揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s弃去，重复5次，拍干；每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外，再置37 ℃温育30 min；重复5次，拍干，每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，震荡混匀，37 ℃避光显色15 min；每孔加终止液50 μL，终止反应，以空白孔调零，450 nm 波长测量各孔吸光度(A)值，计算样品浓度。 1.3.3 细胞裂解液中GPx活力检测

设置5个标准品，分别为600、400、200、100、50 U/L，并设空白对照孔，每个样品均做3个复孔；ELISA检测步骤同上。 1.4 统计分析

数据以(x±s)表示，采用SPSS 20.0软件录入数据并进行统计学分析，用Kolmogorov-Smirnov方法检验各指标是否符合正态分布，符合正态分布则采用单因素方差分析比较组间差异，两两比较采用最小显著差法，两独立样本比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 各种硒化合物对细胞上清中SEPP浓度影响(表 1)

硒化合物作用于HepG2细胞48 h时，与对照组比较，除低剂量MeSeCys组外，其他各剂量硒化合物组上清中SEPP浓度均明显升高(P<0.05)；硒化合物作用于HepG2细胞72 h时，与对照组比较，SeMet、MeSeCys中、高剂量组及Na₂SeO₃高剂量组上清中SEPP浓度均明显升高(P<0.05)；与48 h比较，作用72 h时，低剂量MeSeCys组上清中SEPP浓度下降(P<0.05)。

表 1

表 1 硒化合物对上清中SEPP浓度影响(pg/mL，x±s，n=3) 组别(μmol/L) 作用时间 48 h 72 h 对照组 39.72±1.70 35.59±1.70 Na2SeO3组 0.01 52.28±1.46b 41.78±1.22 0.10 85.49±0.73a 71.72±1.70 1.00 115.78±1.70b 102.70±1.70a SeMet组 0.01 60.37±0.24a 46.43±1.95 0.10 98.91±1.22b 84.29±0.49a 1.00 140.73±0.97a 129.38±0.97a MeSeCys组 0.01 62.95±0.97 46.26±1.22c 0.10 90.83±1.46b 78.61±0.24a 1.00 114.92±1.46b 112.16±0.49a 注：与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01；与48 h比较，c P<0.05。

表 1 硒化合物对上清中SEPP浓度影响(pg/mL，x±s，n=3)

硒化合物作用于HepG2细胞48 h时，与对照组比较，3种硒化合物各剂量组细胞裂解液中GPx活力均明显升高(P<0.05)；硒化合物作用于HepG2细胞72 h时，与对照组比较，除低剂量Na₂SeO₃、MeSeCys组外，其他各组细胞裂解液中GPx活力均明显升高(P<0.05)；硒化合物作用时间48 h与72 h比较，各剂量硒化合物组各指标均未见明显统计学差异。

表 2

表 2 硒化合物对细胞裂解液中GPx活力影响(U/L，x±s，n=3) 组别(μmol/L) 作用时间 48 h 72 h 对照组 152.96±7.56 162.89±4.32 Na2SeO3组 0.01 167.47±6.48a 149.90±7.56 0.10 313.34±1.08a 317.92±5.40a 1.00 490.52±5.40b 472.19±7.56b SeMet组 0.01 380.54±7.56a 340.07±6.48b 0.10 518.78±4.32b 500.45±8.64a 1.00 643.26±5.40b 630.28±2.16b MeSeCys组 0.01 246.26±5.34a 240.98±8.54 0.10 462.93±2.14b 413.12±2.14b 1.00 603.35±6.40b 595.80±2.14b 注：与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 2 硒化合物对细胞裂解液中GPx活力影响(U/L，x±s，n=3)

硒是人体必需微量元素，对人类健康有着重要影响^[3]。硒在生物体内主要以硒蛋白形式参与调节各种生理环节、发挥不同生物学功能^[4]。硒的生物利用率与硒在体内的代谢密切相关，无机硒和有机硒具有不同代谢途径，合成硒蛋白能力也存在差异^{[5, 6]}。关于不同硒化合物生物利用率和生物活性的动物试验结果表明，有机硒的生物活性较高，更能有效地在体内同化，比无机硒的应用效果更好^{[7, 8]}。研究显示，补充硒酸钠(NaSeO₄)和SeMet均能有效提高低硒人体GPx活力，但补SeMet后可见“富裕”硒进入红细胞的血红蛋白和血浆的白蛋白中^[9]；补充SeMet比Na₂SeO₃更易发生硒蓄积^[10]。本研究结果显示，Na₂SeO₃、SeMet和MeSeCys均能刺激HepG2细胞代谢生成SEPP和GPx，且呈剂量依赖效应；其中，SeMet效果最明显，其次为MeSeCys和Na₂SeO₃。本研究未观察到硒化合物作用的时间效应关系，可能与细胞生长状态有关。本研究结果表明，与无机硒比较，有机硒更有利于HepG2细胞代谢生成SEPP和GPx。SeMet是人类通过饮食摄入硒的主要形式，与无机硒比较，SeMet的生物利用率较高且毒性小^[11]。本研究进一步证实不同硒化合物(Na₂SeO₃、SeMet和MeSeCys)因其化学形态不同导致补硒后合成硒蛋白的能力存在差异。因此，针对缺硒地区人群，应以补充有机形式的硒为宜。