中国公共卫生  2015, Vol. 31 Issue (6): 774-776   PDF    
引用本文
张宸豪, 王长文, 方芳, 陈为, 赵良中, 李妍. 姜黄素对LPS活化小鼠巨噬细胞活性氧影响[J]. 中国公共卫生, 2015, 31(6): 774-776.
ZHANG Chen-hao, WANG Chang-wen, FANG Fang, et al. Effect of curcumin on ROS in LPS-activited mice macrophage[J]. Chinese Journal of Public Health, 2015, 31(6): 774-776.
姜黄素对LPS活化小鼠巨噬细胞活性氧影响
张宸豪1, 王长文2, 方芳1, 陈为1, 赵良中1, 李妍1     
1. 吉林医药学院检验学院, 吉林 长春 132013;
2. 吉林医药学院公共卫生学院
数字出版日期：2015-5-20 15:40
基金项目：国家自然科学基金(82102953);吉林省科技厅科技厅中青年科技创新领军人才及团队项目(20130521018JH);吉林省卫生厅项目(2013Z091);吉林省教育厅项目(2014第487号)
作者简介：张宸豪(1972-), 男, 吉林长春人, 副教授, 博士, 主要从事抗感染免疫学研究工作。
通讯联系人：李妍, E-mail:liyan@jlmpc.cn
摘要：目的 研究低浓度姜黄素(curcumin)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)活化巨噬细胞产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)和发生凋亡的影响。方法 体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7, 用LPS(0、0.5、2和8 μg/mL)诱导细胞, 或采用低浓度姜黄素(7.5 μmol/L)与LPS同时作用于巨噬细胞;流式细胞术分析活性氧(ROS)、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)和细胞凋亡。结果 随LPS浓度增加, 小鼠巨噬细胞内ROS增加;高浓度的LPS 导致细胞线粒体功能损伤和凋亡;与对照组比较, 姜黄素处理后, 细胞内活性氧由(8.1±0.8)下降到(6.6±1.3), 差异有统计学意义(P<0.05);与LPS单独作用比较, 姜黄素处理后细胞内活性氧由(61.9±5.3)下降到(47.9±3.8), 差异有统计学意义(P<0.05);低浓度的姜黄素对RAW264.7细胞MMP无明显影响, 但与LPS单独作用比较, 姜黄素处理后细胞内MMP由(37.9±4.7)下降到(33.1±3.4), 差异有统计学意义(P<0.05);低浓度姜黄素单独作用未导致发生明显凋亡或坏死, 与LPS作用比较, 姜黄素明显减少LPS活化后凋亡和坏死细胞的百分率, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 低浓度姜黄素降低了ROS而减轻LPS活化小鼠巨噬细胞的凋亡。
关键词： 脂多糖(LPS)     活性氧(ROS)     巨噬细胞     姜黄素    
Effect of curcumin on ROS in LPS-activited mice macrophage
ZHANG Chen-hao1, WANG Chang-wen2, FANG Fang1, et al    
School of Medical Laboratory,Jilin Medical College, Jilin,Jilin Province 132013,China
Abstract: Objective To study the effect of low concentration curcumin on reactive oxygen species(ROS) production and apoptosis in lipopolysaccharide(LPS)-activated mice macrophages.Methods Mice macrophage RAW264.7 cells were cultured in vitro and administered to LPS at different dosages(0, 0.5, 2, and 8 μg/mL)with or without low dose curcumin(7.5 μmol/L).ROS, mitochondrial membrane potential(MMP), and apoptosis were measured with flow cytometry.Results ROS in RAW264.7 cells increased with the concentration of LPS.Higher concentration of LPS induced cells apoptosis and impeded the function of mitochondria.Compared with the control group, after curcumin treatment, intracellular ROS significantly decreased from 8.1±0.8 to 6.6±1.3(P<0.05).Compared with LPS treatment alone, the intracellular ROS significantly decreased from 61.9±5.3 to 47.9±3.8 after curcumin and LPS treatment(P<0.05).Low concentrations of curcumin had no significant effect on MMP in RAW264.7 cells, but intracellular MMP decreased significantly from 37.9±4.7 to 33.1±3.4 after curcumin and LPS treatment compared with LPS treatment alone(P<0.05).Low dose curcumin treatment alone did not cause significant apoptosis or necrosis of RAW264.7 cells without LPS activation, but significantly reduced the percentage of apoptosis or necrosis of the cells with LPS activation(P<0.05).Conclusion Low dose curcumin reduces ROS production in LPS-activated mice macrophages.
Key words: lipopolysaccharide     reactive oxygen species     macrophage     curcumin    

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是临床上常见的、可致盲性眼底病。年发病率为0.04％～0.16％。视网膜分支静脉阻塞(branch retinod vein occlusion,BRVO)多见，占70％～80％[1]。该病西医无特效治疗方式，中医常用活血化瘀中药改善微循环，但不适合所有类型，且易造成视网膜静脉出血。眼针疗法是治疗中风病的有效方法，可改善脑梗死缺血区的血流，激发脑细胞的功能活动，增加局部脑血流量[2]。有上络于脑、下通脏腑、活血化瘀、通经活络的作用[3]。BRVO位于眼球内，眼针直接作用于眼周，对于眼部的活血活络、祛瘀生新的作用更加直接，治疗BRVO的有效方法。因此，本研究于2014年9月制作兔BRVO模型，观察眼针治疗对比中药血塞通治疗及二者联合治疗微循环改善情况并测二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)最大聚集率及对比病理切片，以检测其疗效。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料

健康青紫兰雄兔50只，4～5月龄，体重(3.0±0.2)kg，雄性。动物来源：由中国北方眼科疾病动物平台(辽宁何氏医学院)提供。注射用血塞通(冻干)(黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，批号:B20131114a)，给药浓度：给药前用生理盐水溶解为5 mg/mL，以5 mg/kg的剂量耳缘静脉注射。 1.2 方法 1.2.1 动物分组及模型制备

将50只青紫蓝兔随机分为5组，每组10只兔(选取右眼为实验眼)。A组：空白组；B组：模型组；C组：中药组；D组：眼针组；E组：眼针+中药组。将B、C、D、E组实验兔术前均以0.2 ml/kg的剂量肌肉注射速眠新，联合1 ml/kg剂量肌肉注射戊巴比妥钠进行麻醉，10 g/L托吡卡胺散瞳。光化学方法[4]建立BRVO动物模型。耳缘静脉注射剂量为3 mg/kg 的30%孟加拉红1 mL，1 min后，以550 nm波长的氙激光照射靶血管3 min。以裂隙灯显微镜下见到的靶血管内红细胞聚集成小块、血管径变细，血流速度明显减慢为照模成功。 1.2.2 治疗方法

造模后1 h开始治疗，C组给予注射用血塞通5 mg/kg耳缘静脉注射，每日1次；D组眼针取穴双眼上焦，肝区，肾区进行治疗。针刺方法：采用0.25×10 mm毫针，常规消毒，于兔眶外侧2 mm处针刺。手法：平刺，进针8 mm。留针30 min。每日1次；E组眼针及血塞通联合治疗，每日1次。共治疗14 d。 1.2.3 激光散斑成像技术眼底微循环的观察

将麻醉后的实验兔搁置于发射光波长785 nm的激光散斑成像仪托台上，在兔眼上安装动物角膜接触镜矫正实验眼屈光参差，找到阻塞静脉，观查视网膜微循环。采集图像时，进入MoorFLPI-2 MeasurementV 1.0软件，设置时间滤波25帧/s，采集频率5 Hz，曝光时间0.5 s，连续采集时间为1 min。分析图像时，利用程序自带的分析功能获得血管直径和血流量结果[5]。血流量以流动的红细胞产生的多普勒位移表示，分别在术后30 min、4 d、7 d、10 d、12 d、14 d作为节点，监测实验动物眼底血栓部位血管管径及血栓部位血流量的变化。 1.2.4 体外ADP聚集率检测

术后14 d，心脏取血5 mL于枸橼酸钠抗凝的抗凝管中，离心后取富含血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)及贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP)。在测定样品方杯中分别加入300 μL PRP 及300 μL PPP，用300 μmol/L浓度ADP做诱导剂，按照LBY-NJ4型血小板聚集仪的使用方法检测最大聚集率。 1.2.5 取材及标本的制备

术后14 d，处死实验兔，立即摘取眼球于4%的甲醛溶液中固定、取材、修块，保留视盘周围1 cm范围内的组织，常规石蜡切片。 1.3 统计分析

实验结果所有数据应用SPSS 14.0统计软件进行分析，以x±s表示，并进行单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结 果

实验过程中，模型组血管管径逐渐变粗。与模型组比较，中药组眼底血栓部位的血管直径明显变细，差异有统计学意义(P<0.01)；眼针组眼底血栓部位的血管直径变化较大，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，表明眼针治疗眼底分支静脉血栓具有一定的效果；眼针+中药组眼底血栓部位的血管直径明显变细，与空白组比较差异无统计学意义(P=0.858)；与中药组比较差异不明显，与模型组、眼针组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05 )。

表 1 眼底血管直径(mm，n=10)
2.2 眼底阻塞部位血流量(表 2)

模型组血流量明显变小，血栓堵塞比较严重，随着时间的延长，血流量逐渐变小；与模型组比较，中药组眼底血栓部位血流量明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；眼针组眼底血栓部位血流量增加，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；眼针+中药组实验动物眼底血栓部位血量增加，与模型组、中药组比较，眼针组差异均有统计学意义(P<0.05)，最接近于空白组水平，血流量基本恢复。

表 2 眼底血管血流量(PU，x±s，n=10)
2.3 ADP最大聚集率

14 d后，空白组正常最大聚集率(40.90±4.91)%。模型组最大聚集率(59.72±8.36)%，较空白组差异有统计学意义(P＜0.05)，与模型组比较，中药组[(46.17±5.84)%]、眼针组[(42.38±4.16)%]、眼针+中药组[(42.01±6.09)%]最大聚集率均降低，差异均有统计学意义(均P＜0.05)，3组差异无统计学意义(P＞0.05)。 2.4 病理检查(图 1)

实验动物模型BRVO病理切片光镜检测：A组，正常动物眼底血管，如箭头所示血管内无红细胞聚集血栓形成；B组，如箭头所示可见明显的红细胞聚集与血管壁粘附紧密，血栓堵塞严重；C组，如箭头所示血管内可见少量的红细胞聚集，集聚红细胞与血管壁无明显粘连，血栓堵塞较轻；D组，如箭头所示血管内红细胞聚集较少，血栓堵塞较轻；E组，如箭头所示血管内少量红细胞聚集，血栓明显减轻。结果表明，眼针组和中药组红细胞聚集程度、与血管的粘附程度均优于模型组，眼针+中药治疗组红细胞聚集程度及与血管的粘附程度优于眼针组及中药组，效果最佳。

注：A:空白组，B:模型组，C:中药组，D:眼针组，E:眼针+中药组。 图 1 视网膜分支静脉血栓病理切片(HE×200)
3 讨 论

视网膜静脉阻塞中医属血症范畴，血塞通的主要成分为三七总皂苷，可活血化瘀、促进纤溶、改善微循环[6]。是治疗RVO的常用药。

兔眼针穴区与人相似[7]，眼针取上焦、肝区、肾区的依据为：病位取穴：眼属上焦，故取上焦穴；循经取穴：“目为肝之窍”，且眼与肝经络上直接联系，《灵枢·经脉》：“肝足厥阴之脉，…连目系”，取肝区；视衣(视网膜)属瞳神范围[8]，五轮学说中属水轮，在脏属肾，又“肝肾同源”，故取肾区。视网膜静脉阻塞中医学病机与中风病相似，多因肝肾阴虚，针刺以上穴区，抑肝阳，滋肾阴，通调脏腑，宁血祛瘀，目得所养则五色可辨。

RVO的形成与血液流变学的改变的关系密切。降低血小板聚集率是改善血栓的有效方式之一[9]。血塞通有抑制体外ADP诱导的兔血小板聚集作用[10]，本研究显示，眼针降低血小板最大聚集率的效果与血塞通无明显差异。针灸可通过改善血液流变学多项指标，降低血粘度，改善微循环来调整机体“内结血瘀”的病理状态[11]。针刺眼周穴位，可改善眼周血管舒缩功能,吸收出血、减轻炎症并促进代谢物的传输,使视网膜得以滋养[12]。可以认为眼针改善微循环的机制之一是通过降低血小板聚集率，而达到“祛瘀”的效果。

参考文献
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