电离辐射、遗传毒性化学物质、化疗药物等均可导致DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)，它是DNA损伤中最严重的形式，若未能修复可致细胞死亡^[1]。DSBs无效修复或错误修复可导致基因组不稳定，表现为染色体重排或染色体缺失，最终致肿瘤及其他年龄相关性疾病的发生^[2]。Phosphorylated histone H2AX(γH2AX)识别抗体免疫荧光法是近年来发展起的一种检测DSBs的方法，它是以流式细胞仪或激光共聚焦扫描电子显微镜为硬件设备,在免疫荧光标记技术的基础上根据DSBs诱导产生γH2AX,且在γH2AX和DSBs的量存在一一对应关系这一事实基础上建立和发展起来的，在真核细胞的整个周期中均可检测到^[3]。与其他DNA损伤的方法相比，γH2AX法具有操作简单、精确、高敏感等优点，被广泛用于识别单一的DSBs研究中。为了解γH2AX法在化合物遗传毒性评估与临床肿瘤的早期筛查及治疗效果评价，本文对近年来γH2AX检测在DSBs研究中的应用进展做如下综述。 1 H2AX磷酸化与DSBs及其修复 1.1 γH2AX的形成

真核生物的DNA以核小体的形式存在于细胞内。组蛋白家族成员有1、2A、2B、3、4，其中H2AX组蛋白是染色质核小体组蛋白核心的成员之一,有H2A1-H2A2，H2AZ和H2AX。组蛋白做为一种高度保守蛋白在DNA加工、修复、基因调控中起重要作用。DSBs发生后，位于DSBs附近的磷脂酸激酶3肌醇家族成员迅速聚集于DNA断裂发生位点磷酸化形成γH2AX，它在DNA损伤应激反应中起扩大信号级联的重要作用。这种DNA损伤应激反应在几分钟内就能出现，因此它被认为是一种早期检测DSBs的最有效的生物学标志物^[4]。近年来发现，真核细胞自身代谢产生的DSBs也可致H2AX磷酸化的产生。如在细胞的减数分裂过程中，DNA的可变-多样性-连接[variable-diversity-joining，V(D)J]重组(在哺乳动物免疫系统的发育过程中出现)及免疫球蛋白开关类基因重组所发生的DSBs均可出现H2AX磷酸化形成γH2AX焦点^[5]。H2AX的磷酸化可以通过毛细血管扩张共济失调突变蛋白激酶(ataxia telangiectasia mutated protein kinase,ATM)、DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)等多种途径实现^[6]。然而有人采用ATM抑制剂处理后并未使H2AX磷酸化水平下降，用DNA-PK抑制剂则可使H2AX水平减弱，后续采用敲除细胞DNA-PK可使γH2AX水平下降，这一系列结果表明H2AX磷酸化是DNA-PK介导的。这可能与刺激物及细胞类型有关^[7]。 1.2 DNA双链的断裂及修复

DNA损伤有多种形式，如DNA单链断裂、DNA与DNA的交联、DNA与蛋白质的交联、DSBs等。其中，DSBs会影响DNA双螺旋结构，被认为是DNA损伤最严重的形式，这种损伤若不被及时修复或被错误修复，会导致DNA遗传物质发生转变从而引发肿瘤及遗传性损伤。例如，电离辐射致DSBs发生后几分钟内就可以产生γH2AX，30 min达到高峰，接着一段时间下降。γH2AX可招募其他信号因子和修复因子聚集于损伤位点，形成电离辐射所致的核焦点^[8],其修复方式主要采用同源重组及非同源末端链接^[9]。H2AX磷酸化可以在整个细胞周期都能检测到，在有丝分裂期形成的γH2AX作为一种指示剂可以在分裂期一结束立即激活DNA损伤修复系统而发挥修复功能。采用电离辐射诱导H2AX磷酸化双峰动力学研究发现G2/M期阻滞可导致γH2AX第二峰出现^[4]。邹鹏等^[10]对博来霉素刺激下肝癌细胞中的H2AX复合物进行了免疫印迹检测发现DNA损伤修复蛋白PARPI和Ku70在DNA损伤后与H2AX相互作用出现了上调，从DNA 损伤修复角度揭示了肿瘤细胞抗药性的分子机制，同时也为肿瘤的分子靶向治疗提供了可靠的依据。 2 γH2AX应用的研究进展

γH2AX作为一种生物学标志物由于在真核生物进化过程中高度保守，H2AX磷酸化实验不仅在人类研究中广泛应用，而且在植物研究中也有报道^[11]。对于 H2AX 的磷酸化的定量研究，最常见的是采用免疫印迹法、免疫荧光法以及流式细胞术等。 2.1 γH2AX与人群研究(表 1)

由于γH2AX可以在整个细胞周期中都可以检测到，且具有操作简单、精确、高敏感等优点而广泛用于临床试验中。免疫组织化学发光法观测γH2AX焦点不仅可以定量DSBs情况而且可以明确损伤部位。在近年来已发表的64篇关于用γH2AX法做人群研究的文章中，50%用于评估医学治疗效果，29.4%采用病例对照研究用于阐明具体病理学过程，7.4%用于环境遗传毒物暴露评价，13.2%用于肿瘤及衰老的描述性研究^[12]。其中，最常见的样本是外周淋巴血液采集和病理组织活检。由于它在发现少量DNA损伤时的高敏感性和特异性、操作时间短、需要很小的生物学样本、自动计数结果方面的优势，越来越多的流行病学家把它作为一种遗传毒性生物标志物运用于人群研究中。

表 1

表 1 γH2AX法作为一种生物标志物在人群研究中的应用 患病情况 样本来源 总例数(对照例数) 检测方法 应用 男性前列腺癌[13] 患者腺体组织 35 免疫荧光法 评估疗效 肝癌[14] 肝脏组织 27 免疫荧光法 评估疗效 女性卵巢癌[15] 输卵管及卵巢组织 30 免疫荧光法 评估疗效 溃疡性结肠炎[16] 结肠组织 96(53) 免疫荧光法 阐明病例过程 胃癌[17] 胃组织 113(47) 免疫荧光法 阐明病例过程 小儿室管膜瘤[18] 颅内肿瘤组织 87 免疫荧光法 评估疗效 转移性肾癌、肝癌、肾上腺皮质癌[19] 肾脏、肝脏、肾上腺组织 101 免疫荧光法 评估疗效 细支气管肺泡细胞癌合并肝癌[20] 肝组织 139 免疫荧光法 描述性研究 低分化尿道上皮癌[21] 经尿道前列腺活检 60 免疫荧光法 评估疗效 子宫内膜异位症[22] 子宫内膜组织 73(35) 免疫荧光法 阐明病理过程 良性子宫内膜息肉[23] 子宫内膜息肉组织 147(137) 免疫荧光法 评估疗效 非小细胞肝癌肾上腺转移瘤[24] 肝癌组织 21 免疫荧光法 评估疗效 初次化疗后的乳腺癌[25] 乳腺组织 60 免疫荧光法 评估疗效 不同时期结肠癌[26] 结肠癌组织 55 免疫荧光法 阐明病理过程 放射线治疗后24h的颈椎癌[27] 劲椎癌组织 26 免疫荧光法 评估疗效 肝癌转移[28] 肝脏组织 42 免疫荧光法 评估疗效 一期子宫内膜癌[29] 子宫内膜组织 106 免疫荧光法 评估疗效 急性淋巴细胞白血病[30] 外周血淋巴细胞 18 流式 评估疗效 急性淋巴细胞白血病化疗后1 h[31] 外周血淋巴细胞 20 流式 评估疗效 电离辐射敏感男性[32] 外周血淋巴细胞 10(5) 免疫荧光法 暴露评价 街头流浪男孩吸烟者[33] 口腔上皮鳞状细胞 252(50) 免疫荧光法 暴露评价

表 1 γH2AX法作为一种生物标志物在人群研究中的应用

自2004年Albino等^[34]将流式细胞仪检测γH2AX法作为一种新的遗传毒性试验^[34]、2005年Gallmeier等^[35]采用免疫荧光法检测γH2AX之后，越来越多的遗传毒理学研究者采用γH2AX方法来研究复杂化合物的遗传毒性。有研究者采用γH2AX法发现卷烟烟雾提取物对支气管上皮细胞有遗传毒性作用，茶多酚对其遗传毒性具有干预作用^[36]。刘海峰等^[37]应用γH2AX法研究DNA损伤时发现石英粉尘可引起DSBs，且存在剂量-效应关系。Smart等^[38]采用了γH2AX法检测大量的遗传毒性化合物，结果证明γH2AX因具有高敏感性和特异性等优点可以被广泛用于评估遗传毒性损伤中。当然需要注意的是由于不同细胞代谢系统的不同，用于体外遗传毒性试验评估化合物毒性时需考虑细胞自身的代谢活性。一些代谢活性差的细胞，研究者们需要归一化细胞代谢活力系统，可以人为地加入一些代谢活化剂来诱导发现前致癌物的形成。Audebert等^[39]采用三种不同的细胞系研究大量的多环芳烃化合物(如苯并芘)，结果表明苯并芘在HepG2细胞中可以发生氧化反应和结合反应，但发现HepG2细胞代谢能力有限，与之前报道一致^[40]。使用有代谢活力的细胞系被认为是提高实验特异性的关键，当然其与方法本身的敏感性无关。在应用γH2AX方法评估吸烟的遗传毒性实验中，肺癌A549细胞及人支气管上皮细胞NHBE同时暴露于吸烟环境中，2种细胞系均显示出γH2AX的产生有剂量依赖效应^[33]，自从吸烟与γH2AX间的这种关系被证实后，γH2AX法被广泛用于评估香烟的不同烟焦油产物研究中。结果表明γH2AX强度的增加与吸烟形成的烟焦油产物增多均有关，与香烟类型、吸烟习惯均无关^[41]。Toyooka等^[42]研究暴露于烟雾环境中的A549细胞，产生的γH2AX有时间、剂量依赖效应。 2.3 γH2AX与细胞凋亡

在外界环境因素刺激下，为了维持内环境稳态，细胞可以在某些基因的调控下自主有效地死亡，即细胞凋亡。目前发现H2AX在细胞凋亡中有新的作用,尤其是紫外线A活化JNK通路使H2AX磷酸化来调控凋亡。研究报道敲除细胞中H2AX基因可以阻碍凋亡的发生，证明了H2AX在调控凋亡中起关键的作用^[43]。有文献更进一步表明H2AX调控凋亡的发生依赖于C-末端磷酸化^[44]，越来越多的文献报道与H2AX相关的肿瘤细胞凋亡^[45]。有研究者采用免疫荧光法检测γH2AX来阐明内质网应激在顺铂诱导宫颈癌细胞凋亡中的作用，结果表明衣霉素可增加内质网应激水平，促进顺铂诱导Hela细胞凋亡^[46]。在γ干扰素(γ-interferon，IFN-γ)诱导小鼠颗粒细胞DNA 损伤及凋亡的体外研究中，吴彬^[47]发现IFN-γ可通过DNA氧化损伤信号引起颗粒细胞凋亡。张慧等^[48]采用观测组蛋白H2AX在高体积分数氧暴露肺泡Ⅱ型细胞中的动态变化来研究H2AX与肺损伤的关系，为早产儿高氧肺损伤的有效防控途径的重新设计打开了新的视野。Lu等^[49]采用去除H2AX基因来抑制139位C-末端H2AX磷酸化，在全基因组转录水平阐明H2AX在肺癌A549细胞凋亡发生中所起的作用，结果表明，在3 461个不同表达基因中，H2AX敲除后可上调1 435个基因表达，下调2 026个基因表达；其中，在研究与肺癌细胞凋亡有关的通路时,雷帕霉素靶蛋白通路(mammalian target of rapamycin,mTOR)和丝裂原活化蛋白激酶通路(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是H2AX调控凋亡中典型的下游通路，在血清饥饿致凋亡发生中，p38MAPK信号通路使H2AX磷酸化参与其中。 2.4 γH2AX与肿瘤

H2AX蛋白与肿瘤的发生、发展及药物敏感性有关，是肿瘤的抑制蛋白，目前关于γH2AX在肿瘤检测及治疗中的应用得到广泛的关注。有研究者在癌前损伤及大量癌组织中发现γH2AX，包括黑色素瘤、结肠癌、骨肉瘤、纤维肉瘤和宫颈癌等，提示在涉及到凋亡和衰老通路时或许它可以运用于肿瘤的早期筛查^[50]。γH2AX法具有耗时间短、高敏感性、低剂量的辐射(1.2 mGy)就可以识别DNA损伤等优点,在肿瘤的放疗治疗中也显示了它的优越性。电离辐射致γH2AX的产生具有线性关系，因此它被广泛用于估计生物学辐射剂量。在放射诊断与治疗中，Zhou等^[51]即采用此方法计算在小鼠模型中以断层为主的电离辐射量。由于在荧光显微镜下观察少量的DNA损伤和潜在的细胞凋亡焦点形态是不同的,它作为一种药效学标志物在临床研究中迅速得到发展，可以更好的用来分析临床患者样本。在已发表的文章中，多篇临床试验采用γH2AX评估癌症患者药物反应，其中在临床一期的应用主要用于评价药物的安全性及其药代动力学，确定最大无作用剂量，明确药物与DNA损伤的关系。组蛋白H2AX作为DNA损伤的有效靶点，可预测肝癌细胞对某些化疗药物敏感性从而提高治疗疗效及避免化疗对正常组织的损伤^[52]。范芳等^[53]采用RNA干扰抑制MRE11基因的表达，进一步揭示肝癌细胞DNA损伤修复与化疗耐药的关系，为肝癌患者临床治疗提供实验依据。在胃癌及胃癌前病变的化学防治中，以丝裂霉素为代表的抗癌药物起关键作用。贾金海等^[54]应用γH2AX评估丝裂霉素对胃癌细胞DNA损伤发现γH2AX法潜在的临床应用价值极高，丝裂霉素对体外胃癌细胞增殖抑制作用明显。PARP酶在DNA双链及单链断裂后可被激活来修复DNA损伤，在肿瘤治疗中采用PARP抑制剂可以杀死携带有BRCA1、BRCA2等缺陷基因调控的DSBs修复^[55]。在另一个药物结合反应研究中，Fandy等^[56]采集骨髓增生异常综合征及急性髓性白血病患者外周血淋巴细胞，采用γH2AX法评价DNA甲基化抑制剂单独作用或与组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合作用的临床效果。尽管γH2AX作为一种生物学标记物用于临床中是一种新的方法，但因其敏感性、高效性、方便性等优点及其在阐明DNA损伤修复研究中的重要的作用，γH2AX法开始被越来越多的临床癌症研究者采用。 3 结 语

γH2AX分析技术相对以前其他监测DSBs的方法具有明显的优势,它可清楚地反映DNA损伤程度和修复情况，更适于研究细胞DNA损伤应激反应机制。对化合物的遗传毒性进行量效评估以及在临床中开展肿瘤的早期筛查与治疗效果评价将是γH2AX分析技术今后主要的应用方向。