先天性小耳畸形(microtia)是一种常见的先天性面部缺陷，在中国汉族人群中发病率约为5.18/万^[1]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸代谢的关键酶，其部分位点的突变可导致酶活性降低以及热稳定性改变，阻断或抑制叶酸代谢途径，从而导致疾病的产生^[2]。最近研究表明，MTHFR基因多态性与一些先天性畸形有关联，如唇腭裂、神经管畸形等，但与先天性小耳畸形的关系未见报道。本研究收集2012—2014年南京地区的先天性小耳畸形患者183例，对照组188例来自同期健康体检者，分析MTHFR 677C-T和1298A-C基因多态性与先天性小耳畸形的关系。现将结果报告如下。

选择2012—2014年在江苏省中医院、南京市第二人民医院和中大医院就诊并符合先天性小耳畸形诊断标准^[3]的患者183例作为病例组。对照组共188例来自同期健康体检者。均获得研究对象或亲属的知情同意。病例和对照为成组匹配，采集全血2 mL，抗凝，-80℃保存。

2×Taq PCR MasterMix(中国 天跟生化科技公司)，Hinf Ⅰ限制性内切酶(美国 Thermo 公司)，NanoDrop 1000微量分光光度计(美国 Thermo 公司)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，基因测序委托北京六合华大基因采用iScan 微珠生物芯片技术平台(美国 Illumina 公司)进行基因分型。

DNA提取采用改良盐析法提取DNA，-20 ℃保存。采用NANODROP 1 000微量分光光度计测定DNA浓度。PCR扩增反应体系为25 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol/μL的上下游引物，DNA模板 300 ng，无酶水。MTHFR 677C-T扩增片段大小294 bp，上游引物5′-CCT TGA ACA GGT GGA GGC CAG-3′，下游引物：5′-GCG GTG AGA GTG GGG TGG AG-3′。1298A-C扩增片段大小163 bp，上游引物：5′-CTT TGG GGA GCT GAA GGA CTA CTA C-3′，下游引物：5′-CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG-3′。反应条件：95℃预变性5 mim；95 ℃ 1 min，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min,35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。反应结束后以3%琼脂糖凝胶电泳检测。

MTHFR 677C-T用Hinf Ⅰ限制性内切酶消化，反应体系为12 μL。置37 ℃水浴过夜，65 ℃灭活 20 min，-20 ℃保存。

MTHFR 677C-T：用4%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，仅有294bp片段的为野生型(CC型)，含有294bp，168bp和126bp 3个片段的为杂合子突变(CT型)，有168bp和126bp 2个片段的为纯合子突变型(TT型)。对MTHFR 1298A-C PCR产物进行了测序，采用双向测序的方法，并进行序列分析。

计算病例组和对照组基因型频率，经Hardy-Weinberg平衡检验，确认样本的群体代表性；采用SPSS 18.0统计包，以双侧P＜0.05为统计学意义的水准，用χ²检验分析样本一般情况以及基因多态性与先天性小耳畸形发病风险关联，根据比值比OR及其95%可信区间(95%CI)的计算评估相对风险度；用SHEsis软件进行连锁不平衡分析和单体型分析。

183例小耳畸形病例组中男性141例，女性42例，平均年龄为(13.34±7.29)岁；188例对照组中男性102例，女性86例，平均年龄为(14.38±7.37)岁，两组年龄分布差异无统计学意义(P>0.05)，性别分布差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组中MTHFR基因677C-T的CC型为31%，CT型为49%，TT型为20%；1298A-C的AA型为69%，AC型为29%，CC型为2%，基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。Hapmap数据库显示在中国汉族人群(CHB)中677C-T的CC型为28%，CT型为48%，TT型为24%；1298A-C的AA型为59%，AC型为37%，CC型为4%，本实验人群与CHB的基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)，具有人群代表性。

表 1

表 1 基因型分布与小耳畸形发病风险关系 位点 基因型 病例组 构成比(%) 对照组 构成比(%) χ2值 P值 OR值 95%CI 677C-T CC 36 19.67 59 31.38 6.75 0.03 1.00 - CT 107 58.47 92 48.94 1.91 1.16~3.14 TT 40 21.86 37 19.68 1.77 0.96~3.26 CT+TT 147 80.33 129 68.62 6.68 0.01 1.87 1.16~3.01 1298A-C AA 132 72.13 129 68.62 0.97 0.59 1.00 - AC 49 26.78 55 29.25 0.87 0.55~1.37 CC 2 1.09 4 2.13 0.49 0.09~2.71 AC+CC 51 27.87 59 31.38 0.55 0.46 0.85 0.54~1.32

表 1 基因型分布与小耳畸形发病风险关系

χ²检验分析显示，MTHFR基因677C-T在病例组与对照组中的基因型频率分布差异有统计学意义(P＜0.05)，与携带CC基因型的个体相比，携带变异型基因(CC+TT)的个体发病风险增加87%。但1298A-C的基因型频率分布在两组中的差异无统计学意义(P>0.05)。

由于病例组与对照组性别分布存在差异，且该疾病在男性中发病率较高，本研究对不同性别的基因型分布与患病风险关系进行了分析。结果显示在男性中MTHFR 677C-T位点的突变与小耳畸形发生风险的关系更为密切(P＜0.05)，携带突变型(CT+TT)的个体与携带CC型个体相比，小耳畸形发病风险增加了130%。但在女性中，未发现这两个位点的突变与小耳畸形的发病风险存在关联(均P>0.05)，这个结果在一定程度上解释了小耳畸形在男性中发病风险较高的原因。

表 2

表 2 不同性别基因型分布与小耳畸形患病风险关系 位点 性别 基因型 病例组 构成比(%) 对照组 构成比(%) χ2值 P值 OR值 95%CI 677C-T 男性 CC 28 19.86 37 36.27 8.17 0.02 1.00 - CT 83 58.87 47 46.08 2.33 1.27~4.28 TT 30 21.27 18 17.65 2.20 1.03~4.72 CT+TT 113 80.14 65 63.73 8.14 0.00 2.30 1.29~4.10 女性 CC 8 19.05 22 25.58 0.67 0.41 1.00 - CT+TT 34 80.95 64 74.42 1.46 0.59~3.63 1298A-C 男性 AA 102 72.34 78 76.47 0.90 0.74 1.00 - AC 38 26.95 23 22.55 1.26 0.70~2.29 CC 1 0.71 1 0.98 -a - AC+CC 39 27.66 24 23.53 0.53 0.47 1.24 0.69~2.24 女性 AA 30 71.43 51 59.30 1.79 0.18 1.00 - AC+CC 12 28.57 35 40.70 0.58 0.26~1.29 注：a 该组频数过低，未参与统计分析。

表 2 不同性别基因型分布与小耳畸形患病风险关系

应用χ²检验分析MTHFR基因677C-T和1298A-C在病例组和对照组中的等位基因频率分布，在总人群中677C-T在两组中的分布差异无统计学意义(P=0.06)，但在男性中677C-T的等位基因频率分布在病例组与对照组中的差异有统计学意义(P＜0.05)，携带等位基因的男性发生小耳畸形的危险性增加了50%，进一步说明该位点的突变对男性的影响更大。1298A-C的等位基因在2组中分布差异无统计学意义(P＞0.05)。

表 3

表 3 等位基因频率分布与小耳畸形发病风险关系 位点 性别 等位基因 病例组 构成比(%) 对照组 构成比(%) χ2值 P值 OR值 95%CI 677C-T 总体 C 179 48.91 210 55.85 3.59 0.06 1.00 - T 187 51.09 166 44.15 1.32 0.99~1.76 男性 C 139 49.29 121 59.31 4.78 0.03 1.00 - T 143 50.71 83 40.69 1.50 1.04~2.16 女性 C 40 47.62 89 51.74 0.38 0.54 1.00 - T 44 52.38 83 48.26 1.18 0.70~1.99 1298A-C 总体 A 313 85.52 313 83.24 0.73 0.39 1.00 - C 53 14.48 63 16.76 0.84 0.57~1.25 男性 A 242 86.82 179 87.75 0.38 0.54 1.00 - C 40 14.18 25 12.25 1.18 0.69~2.02 女性 A 71 84.52 134 77.91 1.55 0.21 1.00 - C 13 15.48 38 22.09 0.65 0.32~1.29

表 3 等位基因频率分布与小耳畸形发病风险关系

用SHEsis软件进行连锁不平衡(linkage disequilibrtum,LD)分析，D’值为0.89，表明本次研究人群中MTHFR基因677C-T和1298A-C基因多态性之间存在连锁不平衡，可以进行单体型分析。连锁不平衡存在时，单体型的数目会减少^[4]，本次实验研究的人群中主要存在3种单体型，合计频率大于99%且TA＞CA＞CC，TC型因频率过低(0.4%)未纳入统计分析。TA单体型为677C-T突变产生，与携带野生CA单体型的个体相比，携带TA单体型的发病风险增加了38%(P＜0.05)，表明677C-T突变对小耳畸形发病风险有影响。

表 4

表 4 MTHFR基因多态性单体型分析 单体型 病例组 构成比(%) 对照组 构成比(%) χ2值 P值 OR值 95%CI CA 127 34.79 152 40.97 4.32 0.12 1.00 - TA 186 50.96 161 43.40 4.04 0.04 1.38 1.01~1.90 CC 52 14.25 58 15.63 1.07 0.69~1.07

表 4 MTHFR基因多态性单体型分析

MTHFR作为叶酸代谢的关键酶，与多种疾病的关系已经广泛被报道。现有研究证明MTHFR的多态性与癌症发病风险的相关，也有人发现其基因突变与先天畸形可能存在关联，但结果并不统一。秦刚等^[5]发现MTHFR 677C-T的TT基因型是非综合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P)的危险因素，郭晋臻等^[6]却发现MTHFR 677C-T多态性和NSCL/P无关联性；韩越等^[7]发现MTHFR 1298A-C有可能是NSCL/P发生的保护因素，而王丽君^[8]认为该位点多态性可能是NSCL/P的遗传易感因子。刘俊等^[9]认为MTHFR 677C-T位点基因多态性与神经管畸形的易感性密切相关，而钟伟等^[10]发现MTHFR基因677C-T和1298A-C突变可能不是单纯性低位脊柱裂的独立遗传致病因素。以上结果表明，MTHFR基因多态性与先天畸形的关系尚无定论，需要进一步研究加以明确。

连锁(linkage)是一种遗传现象，是指位于同一染色体上的某些位点由于相距较近，在生殖细胞减数分裂产生配子时发生同源重组交换的几率较小，而有较大的几率共同从亲代传递到子代^[4]。连锁不平衡是指染色体上线性排列的两个位点上的等位基因非随机地在同一单体型中出现^[11]。单体型，又称单倍型，是一条染色体上紧密连锁的多个等位基因的线性排列组合，可作为一个整体遗传给子代，不会被遗传重组所打断，能够在后代染色体中保持连续稳定的区段^[12]。对于多基因疾病，单体型分析要比单个SNP分析有更大的优越性^[13]。

MTHFR基因多态性与先天性小耳畸形的关系尚未见报道，本实验分析了病例组与对照组基因型频率及等位基因频率，发现MTHFR 677C-T基因多态性与先天性小耳畸形发病率存在相关性，尤其在男性中，这可能是小耳畸形在男性中发病率更高的一个原因，但1298A-C与小耳畸形无关联。研究表明MTHFR基因677C-T突变使高度保守的丙氨酸转变成撷氨酸，从而降低MTHFR活性及热稳定性降低。而MTHFR基因1298A-C突变，可使其编码蛋白的谷氨酸变为了甘氨酸，会使MTHFR酶活性下降^[14]。 ^[15]等证明677C-T多态性与1298A-C相比对MTHFR基因的影响更大。LD分析表明MTHFR两个多态性位点存在连锁不平衡，携带TA突变型的个体与携带野生型个体相比有较高的发病风险，进一步说明677C-T突变可增加先天性小耳畸形的发病风险。

综上所述，本次研究显示MTHFR 677C-T基因多态性与先天性小耳畸形有关联，携带T等位基因可能通过降低MTHFR活性影响叶酸代谢，增加小耳畸形的发病风险，为疾病早期预防提供了依据。鉴于本次研究样本量较小，环境暴露因素不明确，今后的研究中需要更大规模的人群流行病学研究，并进一步考虑到环境与基因的协同作用，以便更科学的解释MTHFR基因多态性与先天性小耳畸形之间的关系。