20世纪80年代随着法医昆虫学在国际上的迅速发展，对侦破刑事案件中的死亡时间、死亡地点、死亡原因推断，尤其为死亡时间推断开辟了新途径^[1]。研究表明,建立在尸食性昆虫基础上的死亡时间推断方法是目前最为有效和精确的方法。利用昆虫生态群落演替现象可推断死后2 d到2周，甚至是若干年的尸体，也能为法医鉴定提供死亡地点和死亡原因等信息^[2]。但蝇卵的发育程度肉眼判断困难。因此，本研究利用扫描电镜观察巨尾阿丽蝇(Aldrichina grahami)卵不同发育时间的形态变化特点，并利用real-time PCR方法检测巨尾阿丽蝇卵不同发育时间的相关基因表达差异，旨在为法医检案更精确地推测死亡时间提供依据。结果报告如下。

于2013年8月采自贵州警官职业技术学院，经法医昆虫学专家陈禄仕教授鉴定；饲养于50 cm×50 cm×50 cm笼内，非恒温，以水、奶粉和白糖喂养。新鲜猪肺为产卵介质，每15 min观察1次，发现产卵后将卵块取出，此时记为发育0 h，每4 h收集1次，每次收集10个蝇卵，直至有幼虫孵出，蝇卵来自同一只成虫，收集平均温度为18.1 ℃，蝇卵于－20 ℃保存备用。

Trizol(美国Invitrogen公司)，脱氧核糖核酸酶I(上海前尘生物科技有限公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水(上海基尔顿生物科技有限公司)，SYBR Green PCR、逆转录试剂盒(美国Thermo公司)，RNaseⅠ(美国Fermentas公司)；ABI-7300 Real-time PCR仪(美国ABI公司)。

磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)清洗冻存蝇卵，待其表面水分完全挥发，使用离子溅射仪将蝇卵喷金，扫描电镜观察其表面超微结构变化。

提取发育0、4、8、12、16 h蝇卵RNA，RNA提取方法参照试剂盒说明书，加入40 μL DEPC水溶解RNA，置于－80 ℃保存备用。使用脱氧核糖核酸酶I试剂盒去除基因组DNA，得到的总RNA直接用于反转录。按试剂盒说明配制反转录反应体系合成cDNA，37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min；合成cDNA保存于－20 ℃。

于美国生物技术信息中心(NCBI)获得bicoid、slalom和几丁质合成酶(chitin synthase)、三磷酸甘油脱氢酶(glycerol 3 phosphate dehydrogenase，GPDH)基因序列：bicoid基因：登录号：NM_057477.4，上下游引物分别为：5′-CTTCAGTTGCCGCCACAATTCC-3′，5′-CAAATGCC-GCTCCACGATTTCC-3′；slalom基因：登录号：NM_001260224.2，上下游引物分别为：5′-CTGGAAAGAGGCAACAAGAC-3′，5′-CCGCCAAAGC-ACCATAATAG-3′；chitin synthase基因：登录号：NM_169052.2，上下游引物分别为：5′-AGTTGGGAGAGGACGGAATAG-3′，5′-GACGGGATGGACAGCAAATAG-3′)；GPDH基因：登录号：NM_001273184.1，上下游引物分别为：5′-CCAAATGCCATCGCTATC-3′，5′-AGCACCTTGCCATACTTC-3′。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。RT-PCR反应体系为：SYBRGreen Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH₂O 9.5 μL，cDNA模板2 μL；反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s；每个样品均做3次重复。用目的基因原始CT值与内参基因CT值之差表示基因相对表达量。

数据采用x±s表示，采用SPSS 19.0软件对CT值及时间进行双变量拟合曲线分析。

巨尾阿丽蝇卵从产下至有幼虫孵出共历时18 h，扫描电镜显示，卵孔一端在早期发育0～4 h内变化不明显，卵孔周围不规则突起较明显(图 1A)；发育8 h卵孔周围变光滑,圆形卵孔可见(图 1B)；发育12 h卵孔消失，所在部位开始皱缩(图 1C)；发育16 h卵孔周围皱缩明显(图 1D)；18 h已发育为幼虫。

图 1

注：A：发育4 h(×500)；B、C、D：发育8 、12、16 h(×1 000)。 图 1 巨尾阿丽蝇卵不同发育阶段形态学变化

结果显示，bicoid基因在发育0～8 h时，表达水平变化不明显，12 h 表达最高；slalom基因表达量整体呈逐渐升高趋势，12 h表达水平最高；chitin synthase基因8 h表达量最高，12 h表达水平最低。

表 1

表 1 不同发育阶段蝇卵基因表达变化(CT值，x±s，n=3) 注：与发育0 h比较，a P<0.05；与4 h比较，b P<0.05；与8 h比较，c P<0.05；与12 h比较，d P<0.05。

表 1 不同发育阶段蝇卵基因表达变化(CT值，x±s，n=3)

将各基因CT值与发育时间做曲线拟合，结果显示，巨尾阿丽蝇卵发育时间与bicoid、slalom、chitin synthase基因表达量之间线性回归方程分别为：y=1.327+0.151x(R²=0.623，P=0.000)，y=4.124+0.112x(R²=0.625，P=0.000)，y=5.390-0.049x(R²=0.291，P=0.038)。提示，巨尾阿丽蝇卵发育时间与bicoid、slalom、chitin synthase基因表达量之间均有较好的线性关系。

贵阳地区巨尾阿丽蝇出现期从12月至次年6月^[3]，不同发育阶段巨尾阿丽蝇卵确定可能有助于推断出更精确的死亡时间。研究表明利用扫描电镜观察蝇卵表面超微结构变化对判断卵发育阶段有一定意义^[4,5]。本研究结果显示，扫描电镜下不同发育阶段巨尾阿丽蝇卵，其形态结构变化存在一定规律。提示通过观察蝇卵发育形态改变，可判定蝇卵发育阶段。

国外研究表明将蝇类蜕变期的卵、蛹期划分为更小的发育单位，根据不同时间段内发育控制基因的表达量不同，即可推断出卵龄^[6,7,8]，法医在案件调查中若现场只有蝇卵等不成熟阶段时，用该法有望将死亡时间细化，推断出更精确死后间隔时间，可为案件侦破提供线索。研究表明在不同发育阶段基因表达水平存在差异^[9,10,11]。本研究选择在蝇卵生长发育过程中起调控作用bicoid、slalom、chitin synthase 3个基因，采用RT-PCR法测定3个基因在巨尾阿丽蝇卵不同发育阶段相对表达量，结果显示，各基因在不同发育时间巨尾阿丽蝇卵中表达量不同，差异均有统计学意义，发育时间与基因表达量间呈较好的线性关系。提示，bicoid、slalom、chitin synthase 等基因表达量可用于蝇卵发育阶段推算，进而使时间精确推断成为可能。