中国公共卫生  2015, Vol. 31 Issue (5): 614-616   PDF    
引用本文
陈魁敏, 周恒伟, 李玉芳, 金戈, 唐迪莹, 李欣欣, 邢爱平, 孟宪锋. 小檗碱改善AD模型小鼠认知障碍作用[J]. 中国公共卫生, 2015, 31(5): 614-616.
CHEN Kui-min, ZHOU Heng-wei, LI Yu-fang, et al. Berberine attenuates cognitive deficits via improving NGF signaling in AD mice[J]. Chinese Journal of Public Health, 2015, 31(5): 614-616.
小檗碱改善AD模型小鼠认知障碍作用
陈魁敏1, 周恒伟2, 李玉芳1, 金戈1 , 唐迪莹1, 李欣欣1, 邢爱平1, 孟宪锋3    
1. 沈阳医学院心理教研室, 辽宁 沈阳 110034;
2. 沈阳市苏家屯区中心医院;
3. 辽宁省精神卫生中心
数字出版日期：2015-4-9 15:37
基金项目：辽宁省教育厅一般项目(L2014409);沈阳市科技局(F13-220-9-27)
作者简介：陈魁敏(1963-),女,辽宁沈阳人,高级实验师,硕士,研究方向:认知行为研究与治疗。
通讯联系人：金戈,E-mail:jinge1026@163.com
摘要：目的 观察小檗碱对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠脑内神经生长因子(NGF)通路变化及改善AD小鼠学习记忆机制。方法 以APP/PS1双转基因小鼠为模型, 采用Y迷宫进行学习记忆能力评价, Western blot检测NGF及相关通路蛋白表达。结果 与对照组[(77.57±11.81)%]比较, 模型组小鼠自发交替反应率[(55.71±12.33)%]降低(P<0.01);与模型组比较, 小檗碱组小鼠自发交替反应率[(70.93±15.99)%]升高(P<0.01);与对照组比较, 模型组小鼠海马NGF、络氨酸激酶(TrkA)、磷酸化蛋白激酶(ERK)、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)表达水平[分别为(0.186±0.031)、(0.187±0.019)、(0.572±0.101)、(0.499±0.138)]均降低(均P<0.05);与模型组比较, 小檗碱组小鼠海马NGF、TrkA、磷酸化ERK、磷酸化CREB表达水平[分别为(0.592±0.043)、(0.281±0.085)、(0.906±0.097)、(0.895±0.152)]均升高(均P<0.05)。结论 小檗碱可以改善APP/PS1小鼠学习记忆障碍, 其机制可能与调控NGF通路有关。
关键词： 小檗碱     阿尔茨海默病(AD)     认知障碍     神经生长因子(NGF)    
Berberine attenuates cognitive deficits via improving NGF signaling in AD mice
CHEN Kui-min1, ZHOU Heng-wei2, LI Yu-fang1, et al    
Mental Health Center for College Students, Shenyang Medical College, Shenyang, Liaoning Province 110034, China
Abstract: Objective To investigate the change of nerve growth factor(NGF) signaling and mechanisms of berberine on learning and memory deficits in Alzheimer's disease(AD) mice.Methods We adopted APP/PS1 mice as AD animal model; we used Y maze to measure learning and memory function and Western blot to investigate the protein expression levels.Results Compared with the control mice(77.57±11.81),the APP/PS1 mice exhibited reduced spontaneous alternation behavior(55.71±12.33)(P<0.01).Berberine(30 mg/kg) attenuate the impairment of spontaneous alternation behavior(70.93±15.99)(P<0.01).The expression levels of NGF,tyrosine kinases(TrkA),phosphorylated extracellular regulated protein kinases(p-ERK),and phosphorylated cAMP-response element binding protein(p-CREB) in the hippocampus were lower in APP/PS1 mice compared to those of the control mice(P<0.05),but were higher in the berberine(30 mg/kg) treated mice compared to those of the APP/PS1 mice(P<0.05).Conclusion Berberine attenuates learning and memory impairments in APP/PS1 mice,possibly through the NGF signaling pathway.
Key words: berberine     Alzheimer's disease     cognition impairment     nerve growth factor    

阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一种常见的与年龄相关神经退行性疾病，主要表现为学习记忆能力减退、认知功能障碍和人格异常等[1]。2010年，国际阿尔茨海默病协会(Alzheimers Disease International，ADI)报告指出全球痴呆症患者数量约为3 560万，其中约39%的患者来自发展中国家，而在2030年这一数字可能会增加1倍[2]。AD不仅给个人和家庭带来沉重的生活与经济负担，也消耗大量的社会医疗资源。本研究以Aβ前体蛋白/早老素蛋白1(APP/PS1)双转基因小鼠为AD模型，考察小檗碱(Berberine)对AD小鼠脑内海马区神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)/络氨酸激酶(tyrosine kinases，TrkA)及其重要下游通路影响，探讨小檗碱改善AD小鼠认知功能障碍的机制，结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

盐酸小檗碱(东北制药集团股份有限公司)，兔抗NGF(美国Bioworld公司)；兔抗TrkA、磷酸化TrkA、蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、磷酸化ERK、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、磷酸化CREB抗体(美国Santa Cruz公司)；Y迷宫装置(成都泰盟软件有限公司)，电泳、转膜设备(美国Bio Rad公司)，凝胶显影系统(上海天能公司)。

1.2 动物分组与处理

7月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠24只，雄性C57BL/6J小鼠12只(北京华阜康生物科技股份有限公司)，许可证号SCXK(京)2009-0004，沈阳医学院实验动物中心饲养，保持环境温度20~21 ℃，湿度60%，自由摄食饮水，12 h循环光照。实验设3组，每组12只动物，分别为对照组(C57BL/6J小鼠，灌胃给予生理盐水)、模型组(APP/PS1小鼠，灌胃给予生理盐水)、小檗碱组(APP/PS1小鼠，灌胃给予30 mg/kg盐酸小檗碱)；给药8周后，进行Y迷宫测试；乙醚麻醉，断头取脑，将新鲜海马组织置于液氮中速冻，保存于-80 ℃冰箱。

1.3 指标与方法

1.3.1 小檗碱对APP/PS1小鼠学习记忆影响

实验装置由呈现Y字型的3个支臂组成，分别称为A、B、C臂，实验时将小鼠放入A臂末端，容许其自由进出3个臂；在5 min时间里，记录小鼠进臂顺序；小鼠连续进入3个不同的臂被定义为一次正确交替反应，记录正确交替反应次数。用自发交替反应率(%)反映空间学习记忆能力。自发交替反应率(%)=正确交替反应次数/(N-2)×100。N为进壁总次数。

1.3.2 小鼠脑海马中NGF通路蛋白表达检测

采用Western blot法，取20 μg海马蛋白提取物(n=3)，加入上样缓冲液，沸水变性后，进行凝胶电泳分离，半干法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，酶联化学法显影。

1.4 统计分析

计量资料采用x±s表示，计数资料采用百分比表示，应用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，最小显著差法进行多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 小檗碱对AD小鼠学习记忆能力影响

对照组、模型组、小檗碱组小鼠自发交替反应率(n=12)分别为(77.57±11.81)%、(55.71±12.33)%、(70.93±15.99)%；与对照组比较，模型组小鼠自发交替反应率均降低，差异有统计学意义(均P<0.01)；与模型组比较，小檗碱组小鼠自发交替反应率均升高，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

2.2 小檗碱对AD对小鼠海马区NGF通路影响(图 1)

对照组、模型组、小檗碱组小鼠脑海马区NGF和TrkA蛋白表达量(n=3)分别为(0.921±0.079)、(0.186±0.031)、(0.592±0.043)和(0.328±0.098)、(0.187±0.019)、(0.281±0.085)；与对照组比较，模型组小鼠海马区NGF、TrkA蛋白表达水平均降低(P<0.01或P<0.05)；与模型组比较，小檗碱组小鼠海马区NGF、TrkA蛋白表达水平均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图 1 小檗碱对小鼠海马NGF、TrkA表达影响
2.3 小檗碱对AD小鼠海马区NGF/TrkA下游通路影响(图 2)

对照组、模型组、小檗碱组小鼠脑海马区p-ERK与p-CREB表达量(n=3)分别为(1.083±0.179)、(0.572±0.101)、(0.906±0.097)和(1.136±0.382)、(0.499±0.138)、(0.895±0.152)；与对照组比较，模型组小鼠海马区p-ERK与p-CREB水平均降低(均P<0.01)；与模型组比较，小檗碱组小鼠海马区p-ERK与p-CREB水平均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图 2 小檗碱对小鼠海马磷酸化ERK、CREB表达影响
3 讨 论

小檗碱，又称黄连素，是从黄连和黄柏等中药中提取的异喹啉类生物碱，目前也可以化学合成，在临床上一直作为抗菌止泻药。近年来随着研究深入，其临床用途已经扩展到糖尿病、心血管疾病等方面[3]。研究发现小檗碱可以通过血脑屏障，在中枢神经系统发挥保护作用，如抗抑郁、抗脑卒中等[4 ,5]。Zhu等[6]研究发现，小檗碱可缓解海马注射Aβ1-40致痴呆模型大鼠学习记忆障碍，抑制脑内炎症因子释放。Panahi等[7]研究发现，小檗碱可以降低β分泌酶(BACE-1)活性，进而对抗铝离子诱导的家兔AD症状。此外，小檗碱还可以抑制APP和糖原激酶3(GSK-3β)的表达水平，保护APP转基因小鼠(TgCRND8小鼠)脑内神经细胞[8]。本研究Y迷宫实验显示，小檗碱30 mg/kg可以提高AD小鼠自发交替反应率，改善APP/PS1小鼠工作记忆及空间记忆能力。提示，小檗碱可以缓解阿尔茨海默病小鼠病情进展。

NGF作为神经营养因子，在神经元生存、分化过程中起关键作用[9]。给予APP/PS1小鼠外源性NGF可以抑制Aβ生成，降低BACE-1和PS1表达[10]。Hsu等[11]研究发现，小檗碱通过提高NGF表达，保护高糖环境损伤的神经母细胞瘤细胞系细胞(SH-SY5Y)。本研究结果显示，APP/PS1小鼠海马NGF及其受体TrkA表达水平降低，小檗碱干预8周后，小鼠海马NGF及TrkA表达水平升高；进一步研究小檗碱对NGF下游Ras/ERK/CREB信号影响，发现小檗碱可提高APP/PS1小鼠海马磷酸化ERK和磷酸化CREB表达水平。提示，小檗碱缓解AD转基因小鼠学习记忆障碍的机制可能与激活NGF/TrkA及其下游通路Ras/ERK/CREB，进而发挥神经保护作用有关。

参考文献
[1] 隋璐, 陈铎, 金戈.EGCG对阿尔茨海默病小鼠神经保护作用及机制[J].中国公共卫生, 2014, 30(10):1282-1284.
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