吴茱萸为《神农本草经》所记载的一味中药，药性辛，苦热，有微毒。其功效主要为温中止呕、散寒止痛、助阳止泻。近年来,研究表明吴茱萸碱具有抗肿瘤作用 ^[1,2,3]。肝癌是中国最常见肿瘤之一，85%~95%的肝硬化患者可发展为肝癌^[4]。肝癌属富血管肿瘤，常可侵入静脉向肝内外转移^[5]，肝癌细胞向肝内外转移是肝癌患者死亡的主要诱因。全球每年新增病例有50%发生在中国^[6]，肝癌因其预后差、生存率低成为危害人类健康的主要疾病之一。本研究以不同剂量吴茱萸碱作用于人肝癌细胞株(HepG2细胞)，旨在观察吴茱萸碱对HepG2细胞的增殖抑制作用及可能机制，结果报告如下。

依氏高糖培养基(Dulbeccos modified eagle medium，DMEM)(美国HyClone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，Matrigel胶(索莱宝)、Transwell细胞培养板、聚偏二氟乙烯膜、默克密理博发光液(美国Millipore公司)；细胞基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)单克隆抗体(美国Abcam公司)，HepG2细胞(贵阳医学院检验学院中心实验室保存)，在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中饱和湿度下培养，待细胞生长至对数期时进行检测。

采用噻唑蓝法，HepG2细胞以每孔1×104个细胞铺在96孔板内，每孔体积100 μL，分别加入含5.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L吴茱萸碱的完全培养液，每孔100 μL，同时设置阴性对照孔及调零孔；分别培养24、48、72 h，每孔加噻唑蓝10 μL，继续培养4 h，弃上清，每孔加二甲基亚砜150 μL，振荡混匀10 min，490 nm处测定吸光度(A)值；每组做6个复孔。细胞增殖抑制率(%)=(1-A测定/A对照)×100%。

细胞接种于6孔板，细胞铺至孔底90%面积时，换无血清培养基饥饿处理12 h，用10μL移液器枪头垂直于孔底轻轻划线刮去细胞，每隔1 cm划一条线，每孔划2~3条；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗去划落细胞，0(对照组)、5.0、25.0、50.0 μmol/L吴茱萸碱的10%胎牛血清完全培养基继续培养24、48 h，100倍镜下观察划痕区，固定同一位置，Image J软件计算划痕宽度(μm)；每组设3个复孔；以划痕愈合面积代表划痕愈合率，划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 或48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度。

采用Western blot法，细胞接种于75 cm²培养瓶内，待细胞铺满80%~90%时，用含0(对照组)、5.0、25.0、50.0 μmol/L吴茱萸碱的10%胎牛血清完全培养液继续培养24 h,收集细胞，提取总蛋白，2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠法计算蛋白浓度；每组取20 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，湿转于聚偏二氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，兔抗人一抗MMP-9(1：5 000)、PCNA(1：1 000)4 ℃孵育12 h，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1：20 000)室温孵育1 h，Tris-HCl缓冲盐溶液清洗后默克密理博发光液显色、曝光，image J软件分析灰度值，以目的条带和内参条带比值进行半定量分析。

实验数据采用(x±s)表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间均数比较采用单因素方差分析,多组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

不同浓度吴茱萸碱作用HepG2细胞，其生长受到不同程度抑制，与对照组比较，随吴茱萸碱浓度增加、作用时间延长HepG2细胞增殖抑制率增加，呈时间、剂量效应关系。

表 1

表 1 吴茱萸碱对HepG2细胞生长抑制作用(x±s，n=6) 组别 (μmol/L) 培养时间(h) 24 48 72 对照组 0 0 0 吴茱萸碱 5.0 17.59±3.16a 52.79±4.22a 67.02±0.42a 12.5 30.95±2.33ab 60.87±0.25ab 70.07±5.15a 25.0 38.11±4.31abc 63.51±2.21ab 74.70±0.96ab 50.0 53.80±1.86abcd 72.00±0.49abcd 83.62±1.04abcd 100.0 58.73±3.79abcde 81.88±4.72abcde 89.28±1.51abcde 注：与对照组比较，a P＜0.05；与5.0 μmol/L组比较，b P＜0.05；与12.5.0 μmol/L组比较，c P＜0.05；与25.0 μmol/L组比较，d P＜0.05；与50.0 μmol/L组比较，e P＜0.05。

表 1 吴茱萸碱对HepG2细胞生长抑制作用(x±s，n=6)

0、5、25、50 μmol/L吴茱萸碱作用HepG2细胞24、48 h划痕愈合率分别为(42.06±4.72)%、(23.31±1.03)%、(10.37±1.06)%、(7.92±1.40)%和(96.35±3.40)%、(13.86±5.57)%、(1.78±3.08)%、0%。与对照组比较，随吴茱萸碱浓度增加，HepG2细胞划痕愈合率逐渐降低(P＜0.05)。

图 1

注：1：对照组；2~4：吴茱萸碱:5.0、25.0、50.0 μmol/L组。 图 1 吴茱萸碱对HepG2细胞划痕愈合率影响(×100)

结果显示0、5.0、25.0、50.0 μmol/L 吴茱萸碱作用24 h HepG2细胞内MMP-9、PCNA蛋白相对表达量分别为(0.78±0.016)、(0.53±0.020)、(0.35±0.020)、(0.21±0.015)和(0.99±0.015)、(0.76±0.032)、(0.66±0.01)、(0.59±0.015)；与对照组比较，5.0、25.0、50.0 μmol/L吴茱萸碱组HepG2细胞内MMP-9、PCNA蛋白相对表达量下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图 2

注：1：对照组；2~4：吴茱萸碱:5.0、25.0、50.0 μmol/L组。 图 2 吴茱萸碱对HepG2细胞MMP-9、PCNA蛋白表达影响

原发性肝癌是中国常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着居民健康。肝癌的手术切除率只有10%~30%^[7]，肝癌的侵袭与转移是其复发及致死的主要原因。因此，研究肝癌侵袭转移的机制，寻找有效抑制肝癌侵袭转移的药物或方法具有重要意义。吴茱萸碱为中国传统中药。研究证实，吴茱萸碱可促进细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的转移，对胃癌^[8]、肺癌^[2]、胶质细胞瘤^[9]、乳腺癌^[10]等多种肿瘤细胞均有抑制作用。PCNA是一种分子量为36 kD的蛋白质，在真核细胞核内合成，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白。PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。本研究结果显示，吴茱萸碱对HepG2细胞生长具有明显抑制作用，呈时间-剂量效应，随吴茱萸碱作用时间延长，PCNA蛋白的表达量逐渐降低。提示吴茱萸碱对HepG2细胞增殖抑制作用，其机制可能与吴茱萸碱抑制PCNA蛋白表达有关。

肿瘤的转移是一个复杂过程，涉及肿瘤细胞脱离原肿瘤组织、在新环境中生存、远处传播和增殖等多个环节^[11]。在肿瘤侵袭转移的过程中,癌细胞对由细胞外基质、间质及基质所组成的组织屏障的突破是极其重要环节。细胞外基质的降解与重塑是肿瘤侵袭和血管生成的基本条件，其中基质金属蛋白酶(MMPs)与肿瘤侵袭转移关系最为密切。MMPs属于内肽酶,是一种Zn²⁺依赖性的中性蛋白酶家族,几乎可水解所有细胞外基质。大量研究表明,恶性肿瘤中MMPs的高表达能够引起邻近肿瘤组织重建和肿瘤内部血管生成,通过降解细胞外基质和基膜,促进肿瘤细胞的侵袭和转移^[12,13]。本研究结果表明,随吴茱萸碱作用时间延长，HepG2细胞MMP-9蛋白表达逐渐降低，划痕实验结果表明吴茱萸碱可明显减慢划痕的愈合速率。提示吴茱萸碱可明显抑制细胞向远处迁徙，这可能是吴茱萸碱抗肿瘤作用的主要机制之一。