近年来，中国正己烷职业中毒报道较多^[1,2]，其代谢产物2,5-己二酮(2,5-HD)是致神经毒性的终毒物^[1]。慢性正己烷中毒患者组织病理学特征为轴索变性和脱髓鞘^[3,4]。P₀(myelin protein zero)是外周神经髓鞘结构蛋白，对维持髓鞘结构稳定起重要作用。神经丝(neurofilament，NF)是神经元特异蛋白和细胞骨架成分，对轴突形态维持至关重要^[5]。文献报道，2,5-HD诱导神经组织 P₀ 和NF表达异常^[6-7]。因此，本研究拟通过观察 2,5-HD 暴露大鼠坐骨神经超微结构变化，检测坐骨神经组织 P₀ 和 NF 表达水平，探讨其关联性。结果报告如下。

2,5-HD(美国 sigma 公司)，纯度≥99%，RNAiso Plus、PrimeScript^TM RT Master Mix、SYBR^ Premix Ex Taq^TM II(大连宝生物公司)，RIPA 强裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、超敏化学发光试剂盒(上海碧云天公司)，兔抗大鼠 P₀ 抗体(武汉三鹰公司)，小鼠抗大鼠 NF-L、NF-M和NF-H 抗体(美国 Cell Signal Technology 公司)；小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG、山羊抗小鼠 IgG(北京中杉金桥公司)。YD-1508 B石蜡切片机(浙江省金华市益迪医疗设备厂)，倒置相差荧光显微镜(日本 Olympus 公司)，透射电镜 H-7500 型(日本日立公司)，TP 800 Thermal Cycler Dice Real Time System(大连宝生物公司)；UVP BioImaging System 凝胶成像分析系统(美国 Upland.CA 公司)。

健康成年雄性 SD 大鼠(大连医科大学实验动物中心)40只，体重(200±15)g，许可证号：SCXK(辽)2008-0002。按体重随机分为对照组和低、中、高剂量染毒组，每组10只。对照组腹腔注射生理盐水，低、中、高剂量染毒组分别按100、200和400 mg/kg腹腔注射2,5-HD，每周连续 5 d，1次 /d，连续染毒5周。

每组随机取2只大鼠，麻醉、灌流、解剖、留取坐骨神经，迅速将坐骨神经切割成约1 mm³大小组织块，2.0%戊二醛固定，丙酮梯度脱水,Epon 812包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，在 80 kV 电压下用 H-600 型透射电镜观察并摄片。

采用RT-PCR法，Trizol法提取坐骨神经组织总RNA，采用反转录试剂盒进行反转录，总反应体积20 μL，42 ℃45 min后反转录，85 ℃10 min灭活反转录酶，-20℃ 保存或立即进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性 95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，40个循环。P₀、NF-L、NF-M和NF-H 的引物序列如下：GAPDH 上游：5′-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G-3′，下游5′-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA-3′；P₀ 上游5′-TCT CAG GTC ACG CTC TAT GTC TTT G-3′，下游5′-CAG CCA GCA GTA CCG GAT CA-3′；NF-L上游5′-CAA GAT GGC ATT GGA CAT TGA GA-3′，下游5′-CTA CCC ACG CTG GTG AAA CTG A-3′；NF-M上游5′-GAC ATC GAG ATC GCC GCA TA-3′，下游5′-GTG TGT GTA CAG AGG CCC AGT GA-3′；NF-H上游5′-CAG AGT ACG CTG CAG TCA GAG G-3′，下游5′-CTC TTG GGC AGA GCG CAT AG-3′。

采用 Western blot 法，预冷组织蛋白抽提试剂，向其内加入 Roche 蛋白酶抑制剂及 PMSF，配制成裂解液，向各暴露组坐骨神经组织中加入裂解液，用眼科剪剪碎后在冰水混合物中用Fluko电动匀浆器 15 000 r/min 匀浆 30 s，在冰上孵育 20 min，4 ℃ 13 000 r/min 离心 20 min，取上清 BCA 法进行蛋白定量；取 100 μg 蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，120 V 电压下电泳1.5 h，电泳结束后转膜，将胶上相应分子量的蛋白转移到硝酸纤维素膜上(P₀、NF-L和NF-M：60 V，2 h；NF-H：100 V，2h)，5%脱脂奶粉封闭4 ℃过夜，一抗孵育(P₀为1:500；NF-L、NF-M、NF-H为1：1 000；GAPDH为1:400)，二抗孵育，化学发光试剂盒检测，扫描胶片，凝胶图像处理系统分析。

实验数据采用x±s差表示，采用 SPSS 13.0 统计软件进行分析，用单因素方差分析(ANOVA)比较各染毒组与对照组间的统计学差异，两两比较采用最小显著差法，P<0.05 表示差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 2,5-HD 对大鼠一般状况影响

对照组大鼠发育正常，毛色有光泽，行动迅速，步态无异常；低剂量 2,5-HD 组大鼠活动减少，后肢轻度外展；中剂量 2,5-HD 组大鼠体格略消瘦，毛色无光泽，活动减少，后肢肌张力下降，外展明显；高剂量 2,5-HD 组大鼠体格消瘦明显，精神萎靡，后肢瘫痪，后脚掌背翻。

对照组大鼠坐骨神经髓鞘呈圆形或椭圆形，结构规整，板层清晰，排列致密；轴索位于髓鞘中心，形状规则，边缘光滑规整；2,5-HD 染毒组随染毒剂量升高 髓鞘形状渐不规则，并出现内折现象；轴索形状渐不规则，部分发生萎缩；神经丝数量渐少，排列稀疏。

图 1

注：a：正常髓鞘；b：髓鞘中略有空泡出现；c：髓鞘有分层；d:神经丝排列致密均匀；e,f,g:神经丝排列逐渐稀疏。 图 1 2,5-HD暴露大鼠坐骨神经组织超微 结构变化(横断面，×10 000)

与对照组比较，400 mg/kg 2,5-HD 染毒组大鼠坐骨神经 P₀ mRNA 表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，随2,5-HD染毒剂量增加，大鼠坐骨神经 NF-L、NF-M、NF-H mRNA 表达逐渐降低，呈剂量-反应关系(P<0.05)。

表 1

表 1 2,5-HD对大鼠坐骨神经组织P0和NF的 mRNA表达影响(x±s，n=10) 组别 (mg/kg) P0 NF-L NF-M NF-H 对照组 1.00±0.02 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.01 2,5-HD 100 1.02±0.05 0.89±0.06a 0.87±0.05a 0.91±0.04a 200 0.91±0.06 0.54±0.02a 0.60±0.07a 0.58±0.03a 400 0.75±0.03a 0.35±0.07a 0.25±0.04a 0.37±0.05a 注：与对照组比较，a P<0.05。

表 1 2,5-HD对大鼠坐骨神经组织P0和NF的 mRNA表达影响(x±s，n=10)

与对照组比较，400 mg/kg 2,5-HD染毒组 P₀ 蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，随 2,5-HD 染毒剂量增加，染毒组大鼠坐骨神经 NF-L、NF-M、NF-H的蛋白表达逐渐降低，呈剂量-反应关系(P＜0.05)。

表 2

表 2 2,5-HD对大鼠坐骨神经组织P0和NF的蛋白表达影响(x±s，n=10) 组别 (mg/kg) P0 NF-L NF-M NF-H 对照组 1.00±0.03 1.00±0.05 1.00±0.04 1.00±0.06 2,5-HD 100 0.95±0.04 0.73±0.08a 0.72±0.07a 0.91±0.05a 200 0.93±0.05 0.44±0.03a 0.24±0.01a 0.56±0.05a 400 0.79±0.04a 0.26±0.02a 0.12±0.03a 0.22±0.02a 注：与对照组比较，a P<0.05。

表 2 2,5-HD对大鼠坐骨神经组织P0和NF的蛋白表达影响(x±s，n=10)

图 2

注：1：对照组；2~4：100、200、400 mg/kg 2,5-HD组。 图 2 2,5-HD暴露对大鼠坐骨神经组织P0和NF的蛋白表达影响

据文献报道，2,5-HD暴露能导致外周神经组织轴索变性和髓鞘脱失^[3,4]。本研究电镜观察显示，对照组大鼠坐骨神经髓鞘质地致密、均匀，神经丝排列均匀、致密，而 2,5-HD 染毒组大鼠坐骨神经髓鞘质地较疏松，尤其高剂量组出现髓鞘分层、缺失等脱髓鞘现象，神经丝数量减少，排列稀疏，且随染毒剂量的增加而加重，提示 2,5-HD 可诱导坐骨神经组织骨架蛋白降解。

P₀是外周神经髓鞘最主要的结构蛋白，而神经丝是神经元细胞骨架的主要成分。研究表明，2,5-HD 暴露大鼠坐骨神经组织 P₀ 表达减少^[8]，NF-L、NF-M和NF-H蛋白水平下降^[9]。本研究结果显示，高剂量 2,5-HD 组大鼠坐骨神经组织 P₀ 基因和蛋白水平显著低于对照组，与文献^[8]结果一致,大鼠坐骨神经组织 NF-L，NF-M 和 NF-H 基因和蛋白水平显著低于对照组，且呈剂量-反应关系，与文献^[9]结果基本一致。提示，2,5-HD 暴露可下调 P₀ 基因表达，下调 P₀ 基因表达很可能是 2,5-HD 导致大鼠坐骨神经组织髓鞘部分缺失的重要机制之一。正常骨架蛋白存在由亚单位到骨架蛋白的聚合和解聚、降解的动态平衡过程。本研究结果显示，2,5-HD 暴露下调 NF-L，NF-M 和 NF-H 基因表达。提示，2,5-HD 很可能通过下调 NF 亚单位基因表达干扰包括 NF 在内的骨架蛋白动态平衡过程，导致轴突萎缩。