流脑是由脑膜炎奈瑟菌引起的起病急，病情发展迅速，如果治疗不及时很快引起死亡的急性呼吸道传染病。建立特异、快速的脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Nm)检测与分群方法，提高病原菌的检出率，有效控制传染源，是控制流脑流行的最有效的途径。传统细菌分离培养、染色镜检、生化鉴定和血清学分群等检测方法不但费时费力，且检测结果受抗生素使用及其他非特异性因素的影响，检出率低。而Nm至少包括13个血清群，全球90%以上的流脑病人均有A、B、C、Y和W135群引起^[1]。本研究采用多重PCR方法同时检测及鉴别Nm的A、B、C、Y和W135 5个血清群，结果报告如下。

Nm各群的阳性对照质控菌株(中国药品生物制品检定所)分别为29019(A群)、29061(B群)、29012(C群)、29303(Y群)和29057(W135群)。阴性对照菌株为肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和乳糖奈瑟氏菌(江西省疾病预防控制中心传染病所实验室分离并保存)。70份Nm分离株(江西省近年流脑临床患者、暴发疫情及带菌者调查中带菌者分离鉴定)23份疑似流脑病人脑脊液标本(江西省市县级疾病预防控制中心)。

营养琼脂、多粘菌素B、万古霉素(北京陆桥有限公司)。卵黄双抗平板、巧克力双抗平板本实验室自配。API NH 鉴定试剂(法国梅里埃公司)，脑膜炎奈瑟菌单克隆抗体诊断血清(美国BD公司)。Taq酶、10×PCR buffer、dNTP Mixture、Marker(100 bp DNA Ladder)、Marker(500 bp)、6×Loading Buffer(宝生物工程(大连)有限公司)。PCR引物(上海生工公司合成)。PCR引物根据参考文献^{[2, 3, 4]}设计(表 1)。

表 1

表 1 扩增Nm各群所用引物 引物名称 引物序列(5′→3′) 鉴定特性 扩增片段长度(bp) Orf - 2 CGCAATAGGTGTATATATTCTTCC′CGTAATAGTTTCGTATGCCTTCTT NmA群 400 siaD(B) GGATCATTTCAGTGTTTTCCACCA′GCATGCTGGAGGAATAAGCATTAA NmB群 450 siaD(C) TCAAATGAGTTTGCGAATAGAAGGT′CAATCACGATTTGCCCAATTGAC NmC群 250 synF(Y) ACGATATCCCTATCCTTGCCTACTGAAGCGTTTTCATTATAATTGCTAA NmY群 75 synG(W135) CAGAAAGTGAGGGATTTCCATACACAACCATTTTCATTATAGTTACTGT NmW135群 120

表 1 扩增Nm各群所用引物

扩增仪(美国Bio-Rad公司)、自动凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)、电泳仪(中国上海天能科技有限公司TANONEPS-100)、超净工作台(中国苏净安泰SW-CJ-2FD)、培养箱(日本EYELA SLI-1200)、高速冷冻离心机(德国SIGMA 3-18K)、生物安全柜(美国Thermo公司)。

挑取菌落于100 μL去离子水于eppendorf管中，放于金属裂解仪中100 ℃ 15 min 后,12 000 r/min 离心5 min，取上清即为PCR 扩增模板。将脑脊液吸取100 μL于 eppendorf管中，放于金属裂解仪中100 ℃ 15 min 后,12 000 r/min 离心5 min，取上清液用于PCR 扩增。反应总体积25 μL，在200 μL 管中依次加入：10×buffer 2.5 μL；dNTPS(每种dNTP 溶液浓度为2.5 mmoL/L) 2 μL ；引物每条1 μL(终浓度1 μmoL/L) ；Taq 酶0.5 μL(5 U/μL)；超纯水8 μL ；模板2 μL 。以阳性对照质控菌株作阳性对照，肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和乳糖奈瑟氏菌作阴性对照。反应程序：94 ℃ 5 min，变性模板DNA ；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min 。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳,500 bp 和100 bp DNA Ladder Marker作参照。

取50 μL 脑脊液直接接种于巧克力培养基，37 ℃ 5%～10% CO₂环境中培养18～24 h，观察细菌生长情况，挑取可疑菌落作氧化酶试验、革兰染色筛选，再采用API NH生化鉴定至种,采用A、B、C、Y、W135各群单克隆抗体血清分型。血清凝集分群按常规玻片凝集方法进行。

70株Nm经多重PCR检测结果为8株A群，12株B群，48株C群和2株W135群，68株与血清分群结果一致。2株血清未能分群的菌株多重PCR检测结果为C群。检出率分别为100%和97.14%。23例流脑疑似病人的脑脊液标本5份检出NmC群siaD(C) 基因，1份检出NmA群Orf-2基因，1份检出NmB群siaD(B)基因。

23例流脑疑似病人的脑脊液标本作细菌培养，4份脑脊液标本培养出可疑脑膜炎奈瑟氏菌。经染色均为革兰阴性双球菌，氧化酶试验阳性，葡萄糖、麦芽糖均(+),蔗糖、乳糖、果糖均(-)，血清学分群鉴定确认4株可疑菌株均为C群脑膜炎奈瑟氏菌，与多重PCR检测结果一致。多重PCR和病原分离培养检出率分别为30.43%和17.39%。Nm菌各群的特异基因均能准确的确定实验所检测的Nm菌株的血清群，作为对照的其他群Nm和阴性对照的金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及乳糖奈瑟氏菌菌株均为阴性。

图 1

注：10:Marker；1～9依次为：NmA、NmB、NmC、NmY、NmW135、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和乳糖奈瑟氏菌 图 1 多重PCR Nm各群的阳性对照质控菌株和阴性对照菌株扩增情况

中国流脑的流行一直以A群为主，2003年以后开始出现C群流脑的暴发和局部地区的流行，近年来一些地区也出现了B群、X群、W135群等感染病例的报道^{[5, 6, 7]}。A群和C群Nm感染可以通过疫苗接种进行预防,但是其它血清群的Nm尚无相应的疫苗,目前只能通过提前用药进行预防，因此，为了采取正确的防治措施,在流脑的诊断中有必要对Nm进行分群检测，这也有助于掌握Nm的血清群流行情况，以便针对性地接种或研发疫苗。快速检测和鉴定病原菌及分群，是及时有效地诊断、控制与预防流脑传播的重要手段。经典的检测方法包括增菌、分离培养、生化或血清学鉴定。这些方法操作繁琐、费时，也受到许多因素的影响，容易造成漏检。而且，对于那些在采样之前接受过抗生素治疗的病例，病原分离率会有一定程度的降低，另外，样品质量、培养条件、诊断血清的质量等一些因素也能影响培养阳性率。普通PCR^[8]对Nm的鉴定及分群是传统方法的一个飞越，但是对Nm的鉴定及分群时需要对每个血清群配置一个反应体系，即一个实验仅能对一个靶基因进行分析，操作时比较麻烦。虽然有人研发了荧光PCR^{[9, 10, 11]}，但是此方法对设备的要求较高，购买昂贵，实验室难以普及。

多重PCR以其突出的优越性得到了广泛的应用，自1988年Chamberlian等^[12]首次提出这一概念起，多重PCR技术已被广泛应用于核酸诊断的许多领域，包括基因敲除分析^[13]、突变和多态性分析^[14]、定量分析以及RNA检测等。在感染性疾病领域，多重PCR技术也己经显示出它的价值。普通PCR及多重PCR对Nm基因分群的目的是了解其血清群,大多数情况下，与血清分群结果一致，但也有少数菌株,因为群特异性基因中有缺失、插入或滑移错配，使其荚膜不能正常表达，表现为血清不可分群，而这种基因序列的改变未能通过基因分群体现出来，因此出现了基因群与血清群不一致的情况^{[15, 16]}。