酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASM)是一类可作用于磷酸二酯键的溶酶体酶，水解细胞膜表面或溶酶体中的鞘磷脂生成神经酰胺(ceramide)和磷酰胆碱，而神经酰胺作为第二信使与细胞凋亡、分化、增殖、自噬、衰老等多种生物学进程密切相关^[1,2]。国内外对生物样品中ASM活性检测已有相关报道^[3,4,5]。以³H标记的鞘磷脂为反应底物，通过测定水解产物的放射活性，间接推算ASM活性^[3]，还可采用试剂盒测定ASM活性，以Amplex Red染料进行荧光标记后相对定量测量^[4]，此方法成本较高、荧光易淬灭，不适合进行大批量样品的测量。本研究以荧光标记衍生物为检测对象，建立一套反向颗粒填充柱分离、荧光检测器检测的分析方法，并对测试条件和仪器各项参数指标进行优化，结果报告如下。

选取健康SPF级昆明小鼠12只，体重为18~22 g(长沙市开福区东创实验动物科技服务中心)，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2009-0012号。喂养条件，温度25 ℃、湿度50%、自由饮食饮水、14 h光照和10 h黑夜，实验前观察2周。

BODIPY^® FLC₁₂-Sphingomyelin(美国Invitrogen公司)；B₁₂-Ceramide(美国Cayman Chemical公司)；Igepal-630(美国Sigma公司)；甲醇、乙醇(色谱纯，美国Tedia公司)；氯化锌、乙酸铵、磷酸(分析纯，天津科密欧公司)。高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；Q5000型高精度超微量紫外分光光度计(美国Quawell公司)；电动玻璃匀浆机(宁波新芝公司)；低温高速离心机(上海力康公司)。

高效液相色谱仪，配SIL-20A型自动进样器、LC-20AT泵、RF-20A荧光检测器；色谱柱参数，ACQUITY BEH C₁₈柱(1.7 μm，2.1 mm×30 mm)；1.5 mL自动进样瓶(带内插管)；荧光检测器设置，激发波长505 nm，发射波长540 nm；流动相配制，甲醇：13 mmol/L乙酸钠溶液(V ∶V)=95∶5；流速0.8 mL/min；进样量为10 μL。

分别取B₁₂-Cer标准应用液(浓度为10 μmol/L)0、40、80、120、160、640、1 280、2 500、5 000 μL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，使终浓度为0、40、80、120、160、640、1 280、2 500、5 000 nmol/L。每个标准品重复进样3次，以峰面积为Y轴，B₁₂-Cer含量为X轴绘制标准曲线。

小鼠颌下静脉丛取全血约500 μL，肝素钠抗凝，4 000 g离心5 min，取上清，置于-20 ℃待测；使用代谢笼收集小鼠24 h尿，4 ℃保存待测；小鼠禁食过夜，4%水合氯醛麻醉后，U型切口剪开小鼠腹腔，取约1 g肝组织，用生理盐水漂洗2遍，拭干称重后剪碎，冰浴制成10%肝组织匀浆，4 000 r/min离心5 min，取上清置于-20 ℃待测。

取3 μL组织匀浆放入干净的0.5 mL离心管中，加入3 μL已配制好的ASM反应底物(100 μmol/L B₁₂-Spm、0.2 mmol/L ZnCl₂、0.2% Igepal CA-630、0.2 mol/L乙酸钠，pH=5.0)，充分混匀，37 ℃孵育2 h。待反应结束后，取5 μL孵育液加入95 μL乙醇中，终止反应。混匀，12 000 g离心5 min，取上清液，置于1.5 mL带内插管的自动进样瓶，上机测试。

B₁₂-Spm在ASM激活水解作用下，生成带有荧光基团的B₁₂-Cer，底物(B₁₂-Spm)和产物(B₁₂-Cer)的保留时间分别为1.711和0.948 min。

图 1

图 1 B12-Spm 和B12-Cer的标准色谱图

选取不同荧光底物孵育时间0.5、1、2、4、8、12 h，选取不同荧光底物孵育温度4、37、70 ℃，测定肝组织匀浆的ASM活性。结果显示，荧光孵育2 h内B₁₂-Cer检出量上升最快，之后达到平台期，而37 ℃孵育效果优于4 ℃和70 ℃。最终确定本方法最优孵育时间为2 h，孵育温度为37 ℃。

B₁₂-Cer响应灵敏，基线噪声低，线性关系好。标准曲线为y=536.76x+18 559，R²=0.998 8，根据色谱条件和仪器参数，结合相关文献^[6]分析，以3倍信噪比确定方法检出限为5.86 nmol/L(S/N=3)，以10倍信噪比确定方法定量限为19.53 nmol/L(S/N=10)。

测定3个浓度120、2 500、5 000 nmol/L的重现峰，重复测量6次。峰面积相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为2.2%~4.7%。将浓度为2 500 nmol/L B₁₂-Cer标准液于室温避光放置6、12、24、48、72 h后检测，荧光信号强度在24 h之前只有1%衰减，72 h达3%。分别取小鼠3 μL血浆、尿液和肝组织匀浆各2份，其中1份加入120 nmol/L的B₁₂-Cer标准液，测定样品回收率，结果显示小鼠血浆、尿液和组织匀浆的加标回收率分别为87.3%、78.4%、83.6%。

正常成年昆明小鼠血浆中ASM活性为(927.40±189.62)nmol/(μL·h)，24 h尿液中ASM活性为 (122.88±49.84)nmol/(μL·h)，10%肝细胞匀浆中ASM活性为(422.51±65.81)nmol/(μL·h)。

图 2

图 2 成年小鼠血浆、尿液和肝组织匀浆中ASM活性高效液相色谱图

本方法最大优点是4 min即可完全分离B₁₂-Cer和B₁₂-Spm，且使用自动进样器提高了检测效率。既往的ASM活性测定方法耗时较长，单个样品通常要>6 h，而本方法有效的避免了人力和时间的浪费，可用于大规模人群普查。方法检出限可精确测量到纳摩尔级别，检出率高。稳定性检测结果显示，孵育荧光底物24 h内上机测试，产物荧光强度衰减很少。取同样体积(3 μL)生物样品，ASM活性在血浆中更易检出，而尿中则较低，这可能与正常生理状态下，ASM不易透过肾小管过滤有关。近年来生物医学领域的研究不再局限于核酸、蛋白水平，对于小分子脂类的研究越来越深入，同时更多的关注蛋白表达后对酶活性的功能改变^[7]。高效液相色谱法，对仪器设备要求不高，操作流程快、简便，结果准确、可靠，用于检测生物样品中ASM活性效率高、成本低，可适用于大规模的人群筛查、生物标志物的开发等。