秦皮甲素是中药秦皮中的主要成分，又称七叶苷，七叶灵，马栗树皮苷。秦皮甲素在中药秦皮中含量最高，为1.436%~3.043%^[1]。研究表明，秦皮甲素具有止咳平喘、抗炎镇痛、抗病原微生物、抗病毒、抗肿瘤等作用^[1]，秦皮甲素可以促进人肺癌细胞H-125凋亡^[2]。本研究拟观察秦皮甲素对肺癌细胞A549增殖、凋亡的影响，并对其作用机制进行探讨。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

人肺癌细胞A549(中国医科大学)用含10%胎牛血清1640培养液，在37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中培养，每2 d换液1次，待细胞长至对数生长期时进行试验；秦皮甲素(北京中国食品药品检定研究所)，兔抗人Bax、Bcl-2抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，兔抗人caspase-3抗体(上海领成生物科技有限公司)，线粒体膜电位试剂盒(JC-1)、细胞周期检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；annexinV-PI凋亡试剂盒(北京宝赛生物有限公司)，胰蛋白酶(上海慧颖生物科技有限公司)，1 640培养基(南京凯基公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)。XD-101型倒置显微镜(日本Olympus公司)，流式细胞仪(美国BD公司)，凝胶成像仪(美国BioRad公司)，二氧化碳培养箱(美国杜邦公司)，9602A酶标仪(北京普朗公司)。 1.2 指标与方法 1.2.1 细胞增殖抑制率检测

采用MTT法，取对数生长期肺癌细胞A549，用0.25%胰酶消化，以(5~10)×10³个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，将细胞分为阴性对照组，阳性对照组[5-氟尿嘧啶(5-Fu)0.77 mmol/L)]，秦皮甲素组(秦皮甲素0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L)，每孔200 μL，培养48 h后中止反应，每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h，上清弃去，每孔加入二甲基亚砜150 μL，在摇床上振动混匀10 min，在酶标仪上490 nm波长处检测各孔吸光度(A)值.细胞增殖抑制率(%)=(1-处理组A值／对照组A值)×100％。实验重复3次，计算平均抑制率。 1.2.2 秦皮甲素对A549细胞周期影响

采用流式细胞仪检测，取对数生长期的肺癌细胞A549，用1640培养液培养24 h后，将细胞分为阴性对照组，阳性对照组(5-Fu 0.77 mmol/L)，秦皮甲素组(0.4、0.8、1.6 mmol/L)，继续培养48 h后收集各组细胞，4 ℃70%冷乙醇固定24 h，800 r/min离心6 min弃去固定液，50 μg/mL碘化丙啶1 mL染色，4 ℃避光30 min，试验重复5次，流式细胞仪分析细胞周期。 1.2.3 秦皮甲素对A549细胞凋亡影响

采用流式细胞仪检测，分组与处理同1.2.2，各组细胞用0.25%胰酶消化，800 r/min离心5 min收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，4 ℃1 000 r/min离心10 min，加入10 μL annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15 min，再加入5 μL碘化丙啶，1 h内用流式细胞仪检测，分析细胞凋亡率。试验重复5次。 1.2.4 秦皮甲素对A549细胞线粒体膜电位影响

采用流式细胞仪检测，取对数生长期的肺癌细胞A549用1640培养液培养24 h，分组预处理同1.2.2，收集各瓶细胞，800 r/min离心5 min，PBS洗2遍，加入0.5 mL 1 640培养液和0.5 mL JC-1染色工作液，混匀，37 ℃孵育20 min；孵育结束后，600 r/min离心4 min，沉淀细胞，去上清。用JC-1染色工作液(1×)洗涤2次，再用0.5 mL JC-1染色工作液(1×)重悬后，流式细胞仪检测，采用绿色荧光细胞百分率表示线粒体膜电位变化。 1.2.5 秦皮甲素对A549细胞凋亡相关蛋白表达影响

采用细胞免疫印迹法，细胞分组与处理同1.2.2，4 ℃ 12 500 r/min离心5 min，收集上清，测定蛋白浓度；15%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，加入1:1 000稀释一抗(Bax、Bcl-2、caspase-3)，4 ℃过夜，洗膜3次。加入1:2 000稀释的二抗孵育50 min，洗膜3次。显色、照相。试验重复5次。 1.3 统计分析

数据均以x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析及最小显著差法进行组间两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 秦皮甲素对A549细胞增殖影响

秦皮甲素0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L组、5-Fu组人肺癌细胞A549增殖抑制率分别为35.9%、46.1%、50%、65.4%、71.8%、64.2%，明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；秦皮甲素可明显抑制肺癌细胞A549增殖，且随着秦皮甲素浓度升高，抑制率也明显增大，IC₅₀值为0.4 mmol/L。 2.2 秦皮甲素对A549细胞周期影响(表 1)

与对照组比较，秦皮甲素各剂量组A549细胞G2/M期细胞比例减少，S期细胞比例增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1

表 1 秦皮甲素对人肺癌细胞A549细胞周期影响(％，x±s，n=5) 组别(mmol/L) G0/G1 S G2/M 对照组 42.1±0.11 3.97±0.07 45.75±0.13 5-Fu 44.9±0.18 13.76±0.14b 36.45±0.19a 秦皮甲素    0.4 43.7±0.09 7.99±0.08 45.19±0.08                     0.8 45.1±0.24 17.64±0.17b 33.75±0.21a                     1.6 44.6±0.19 20.35±0.26b 25.46±0.17a 注：与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 1 秦皮甲素对人肺癌细胞A549细胞周期影响(％，x±s，n=5)

结果显示，对照组、秦皮甲素0.4、0.8、1.6 mmol/L组和5-Fu组A549细胞凋亡率分别为2.17%、14.93%、22.41%、29.15%和24.76%；与对照组比较，秦皮甲素各剂量组与5-Fu组A549细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；呈剂量-效应关系。 2.4 秦皮甲素对A549细胞线粒体膜电位影响

结果显示，对照组、秦皮甲素0.4、0.8、1.6 mmol/L组和5-Fu组A549细胞绿色荧光细胞百分率分别为 0.09%、13.75%、24.31%、32.58%和23.49%；与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；提示A549细胞线粒体膜电位随着秦皮甲素浓度增高而降低。 2.5 秦皮甲素对A549细胞凋亡相关蛋白表达影响(图 1、表 2)

秦皮甲素作用于人肺癌A549细胞48 h后，与对照组比较，秦皮甲素组A549细胞Bax和caspase-3蛋白表达增强，Bcl-2蛋白表达减弱。

图 1

注：1：对照组，2：5-Fu组，3~5：秦皮甲素0.4、0.8、1.6 mmol/L组。 图 1 秦皮甲素对人肺癌A549细胞凋亡相关蛋白表达影响

表 2

表 2 秦皮甲素对人肺癌A549细胞凋亡相关蛋白表达影响(x±s，n=5) 组别(mmol/L) Bax Bcl-2 caspase-3 对照组 0.24±0.08 0.75±0.04 0.21±0.06 5-Fu 0.61±0.05b 0.59±0.06a 0.62±0.09b 秦皮甲素    0.4 0.41±0.07a 0.71±0.14 0.35±0.07a                     0.8 0.56±0.06b 0.63±0.07a 0.59±0.06b                     1.6 0.69±0.11b 0.42±0.13b 0.74±0.15b 注：与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 2 秦皮甲素对人肺癌A549细胞凋亡相关蛋白表达影响(x±s，n=5)

细胞周期是正常连续分裂的细胞从前一次有丝分裂到下一次有丝分裂完成所经历的连续动态过程。细胞凋亡是一种重要的生命现象，Bcl-2基因家族在细胞凋亡的线粒体途径中作为重要的调节因子，直接参与细胞凋亡的调控。Bcl-2是抗凋亡因子，当促凋亡因子Bax高表达时，形成同源二聚体，抑制Bcl-2抗凋亡作用，从而诱导细胞凋亡^{[3, 4, 5, 6]}。本研究结果表明，秦皮甲素可将A549细胞周期阻滞于S期，G2/M期细胞减少，从而抑制细胞增殖；同时秦皮甲素可使Bax蛋白表达增强，Bcl-2蛋白表达减弱，诱导人肺癌A549细胞凋亡。

在细胞凋亡过程中，caspase-3是 caspase 家族中引发细胞凋亡的关键酶，当细胞发生凋亡时变为有活性的 caspase-3，并作用于 caspase 家族的其他成员，最终降解靶细胞内的结构蛋白和对细胞周期起调控作用的蛋白等，从而导致细胞凋亡^{[5, 6]}。而线粒体是细胞凋亡发生发展的关键场所，在致凋亡因子的刺激下，线粒体膜电位降低或丧失，线粒体产生形态和功能的改变，生物膜通透性改变，孔道开放^{[7, 8, 9, 10]}。本研究结果显示，秦皮甲素作用后，A549细胞 caspase-3 蛋白表达呈剂量依赖性增强，细胞线粒体膜电位下降。提示秦皮甲素可抑制人肺癌细胞A549增殖，将细胞周期阻滞于S期，并通过使线粒体膜电位下降而诱导细胞凋亡。然而，秦皮甲素诱导A549细胞凋亡具体机制尚需进一步研究。