先天性心脏病(congenital heart disease,CHD) 是一类胚胎期心血管系统发育异常所引起的先天畸形，是人类发病率最高的出生缺陷，在足月和活产的新生儿中，CHD的发病率为4‰~10‰，目前已成为中国城市0~5岁婴幼儿死亡的首要原因^[1]。CHD的病因及发病机制尚不清楚，目前认为大多数CHD是环境因素与遗传因素共同作用所致的多基因遗传病。近年来，在研究基因-环境交互作用的方法学上进展较快，包括分层分析方法(病例对照研究或单纯病例研究)、采用多因素logistic回归模型分析方法以及相对危险度的方法等^{[2, 3, 4]}。本研究采用以医院为基础的病例对照研究方法，对2012年7月—2013年10月在山东省4家医院胸外科住院的137例CHD患儿及同期住院的132例无CHD及其他畸形的其他疾病患儿母亲进行问卷调查，并采集患儿空腹外周静脉血进行DNA提取和基因检测，应用叉生分析方法分析CHD致病MTHFR基因C677T位点突变与环境因素(孕期患病情况)的交互作用，旨在为CHD的病因研究提供新的分析方法。结果报告如下。 1 对象与方法 1.1 对象

将2012年7月—2013年10月在泰安市中心医院、泰安市儿童医院、济南市儿童医院及泰山医学院附属医院胸外科住院的137例CHD患儿作为病例组；选择此4家医院同期住院的132例无CHD及其他畸形的其他疾病患儿作为对照组。病例组与对照组患儿年龄均<14岁。所有CHD患儿均为经过临床诊断、彩色多普勒超声心动图诊断、X线检查确诊，并排除心脏血管之外的其他畸形者。 1.2 方法 1.2.1 问卷调查

自行设计调查问卷，由2组患儿的母亲在经统一培训的调查员指导下自行填写，填写完成后由调查员进行完整性、逻辑性检查无误后，当场收回问卷。内容包括患儿的性别、年龄及患儿母亲的年龄、文化程度、母亲孕期是否患病(包括感冒、发烧、妊高症等)。 1.2.2 标本采集

抽取病例组与对照组患儿的空腹外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)-Na₂抗凝，置于-70 ℃ 冰箱备用。 1.2.3 DNA提取和基因检测

DNA提取和PCR扩增采用大连宝生物公司的全血DNA提取试剂盒，操作按说明书进行。PCR扩增所用上游引物：5′-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3′，下游引物：5′-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3′。PCR反应体系总体积50 μL，PCR反应条件：95 ℃ 预变性5 min，然后40个循环(94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 复性39 s，72 ℃ 延伸30 s)，72 ℃ 延伸7 min，最后置于4 ℃ 保存。经PCR产物酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果判定各基因型。 1.3 统计分析

采用Excel 2007建立数据库，应用SPSS 13.0统计软件进行 χ²检验和秩和检验，采用叉生分析表法^{[4, 5, 6, 7]} 分析CHD致病MTHFR基因C677T位点突变与环境因素(孕期患病情况)的交互作用。 2 结 果 2.1 一般情况

病例组137例CHD患儿中，男童72例(52.55%)，女童65例(47.45%)，中位年龄为2.26岁；患儿母亲年龄22~38岁，中位年龄为27.77岁；母亲文化程度初中及以下21人(15.33%)，高中及职高85人(62.04%)，大专及以上31人(22.63%)。对照组132例其他疾病患儿中，男童79例(59.85%)，女童53例(40.15%)，中位年龄为2.59岁；患儿母亲年龄22~37岁，中位年龄为26.83岁；母亲文化程度初中及以下10人(7.57%)，高中及职高88人(66.67%)，大专及以上34人(25.76%)。2组患儿及患儿母亲一般情况比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。 2.2 2组患儿MTHFR基因677位点基因型、等位基因频率比较(表 1)

对照组患儿MTHFR基因677位点基因分布Hardy-Weiberg遗传平衡检验结果显示，对照组MTHFR基因遗传平衡，具有人群代表性(χ²=3.651，P=0.161)。病例组与对照组MTHFR 677位点全基因型和等位基因频率比较，差异均有统计意义(χ²=13.045、17.045，P<0.01)。分别对病例组和对照组患儿CC、CT、TT 3种基因型频率进行比较，结果显示，2组患儿CC和TT基因型频率差异均有统计意义(χ²=8.411、10.181，P<0.01)，CT基因型频率差异无统计意义(P>0.05)。

表 1

表 1 病例组与对照组患儿MTHFR基因677位点基因型频率比较 组别 基因型 等位基因 例数 CC CT TT 例数 C T n % n % n % n % n % 病例组 137 28 20.44 53 38.69 56 40.87 274 109 39.78 165 60.22 对照组 132 48 36.36 54 40.91 30 22.73 264 152 57.58 112 42.42 χ2值 8.411 0.139 10.181 17.045 P值 0.004 0.710 0.001 <0.001

表 1 病例组与对照组患儿MTHFR基因677位点基因型频率比较

病例组137例CHD患儿中，MTHFR基因 677位点突变109例(79.56%)，CHD患儿母亲孕期患病61例(44.53%)；对照组132例其他疾病患儿中，MTHFR基因 677位点突变84例(63.64%)，患儿母亲孕期患病21例(15.91%)。叉生分析结果显示，CHD致病MTHFR基因C677T位点突变与环境因素(孕期患病情况)基于相加模型的交互作用差异有统计学意义(U=2.060，P=0.020)，各评价指标：SI=4.85，AP=70%，AP^*=79%，RERI=5.64；基于相乘模型交互作用差异无统计学意义(P>0.05)。

表 2

表 2 MTHFR基因 677位点突变与环境因素交互作用叉生分析表 G E 病例数 对照人数 OR值 95%CI + + 54 13 8.11 3.64~18.09 + - 55 71 1.51 0.80~2.85 - + 7 7 1.95 0.61~6.31 - - 21 41 1.00 注：G(+)：MTHFR基因677位点突变C→T(包括突变杂合子和纯合子)；G(-) ：MTHFR基因677位点未突变；E(+)：母亲孕期患过感冒、发烧、妊高症等疾病；E(-)：母亲孕期未患过感冒、发烧、妊高症等疾病。

表 2 MTHFR基因 677位点突变与环境因素交互作用叉生分析表

对于多基因、多环境因子及其交互作用的复杂疾病，需要利用统计方法例如叉生分析、logistic回归模型等来分析基因和环境因素的交互作用。本研究应用叉生分析表法以母亲孕期是否患感冒、发烧、妊高症为环境因素(E)，MTHFR基因C677T位点突变为遗传因素(G)，比较基于不同模型(相加和相乘模型)的2个因素对CHD的交互作用，结果显示，CHD致病MTHFR基因C677T位点突变与环境因素(孕期患病情况)基于相加模型的交互作用差异有统计学意义(U=2.060，P=0.020)，基于相乘模型交互作用差异无统计学意义(P>0.05)。说明2个因素对CHD的交互作用表现为相加效应，但不具有相乘交互作用，与本课题组前期应用logtistic模型分析的结果一致^{[2, 8]}。相加模型各评价指标：SI=4.85，说明2个因素间存在正相加交互作用，即同时存在2个因素时会使效应增强；AP=70%，说明因素间的交互作用较强；AP^*=79%，说明由基因和环境2个因素引起的疾病效应中归因于两因素交互作用的比例相对较大；RERI=5.64，说明描述归因于交互作用的危险度较大。

本次分析可以看出，叉生分析表作为病例对照研究中基本的流行病学分析单元，具有计算简单、直观、信息量丰富等特点。利用叉生分析结果识别基因-基因、基因-环境的交互作用，可以合理地解释基因之间及基因与环境之间的交互作用。但是此分析方法也存在不足之处，即叉生分析表只可以分析2个二分类因素间的交互作用，末考虑其他不参加叉生分析的基因与环境因素的作用，所以应将其与多因素回归分析(如基于相乘模型的logistic回归分析、基于广义相对危险度模型的分析)相结合^[6]，才能得到更为合理的信息。因此，叉生分析表在流行病学分析,尤其是交互作用的分析中，其作用需要进一步挖掘利用。