糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病主要的心血管并发症之一。DCM 可以造成细胞代谢异常，导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介导的凋亡通路在 DCM 细胞凋亡过程中所发挥的重要作用日益受到重视。芒果苷(mangiferin)也称为知母宁，是芒果叶、扁桃叶及知母等中药材的有效成分，具有降血糖、抗癌、抗病毒等活性。本研究通过建立糖尿病模型，观察芒果苷对糖尿病大鼠心肌肌醇依赖酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASKl)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)影响，从而探讨芒果苷抗糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的机制。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

芒果苷(南宁维康医药科技有限公司)，链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美国 Sigma 公司)，兔抗鼠 IRE1 抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，兔抗鼠 ASK1、JNK1/2 抗体(武汉博士得生物工程有限公司)；Sure Step Plus 血糖检测仪(美国强生公司)。 1.2 动物分组及模型制备

健康雄性 SD 大鼠(辽宁医学院实验动物中心)50 只，230～280 g，SCXK(辽)2008－2013，随机选取10只作为对照组，另外40只用于建立糖尿病模型，对照组注射枸橼酸缓冲液，造模大鼠空腹 12 h 后给予 STZ 45 mg/kg 尾静脉注射，72 h 后尾静脉采血测定血糖，血糖浓度≥16.7 mmol/L 大鼠为糖尿病模型成功，将造模成功35只大鼠随机分为糖尿病组(n=8),芒果苷低、中、高剂量组(n=9，分别灌胃给予芒果苷15、30、60 mg/kg)，连续12 周，对照组和糖尿病组给予等量生理盐水。 1.3 指标与方法 1.3.1 血糖测定

用SureStep Plus型血糖仪于实验结束前检测各组大鼠空腹血糖。 1.3.2 心功能测定

大鼠20％乌拉坦(5 mL/kg)麻醉，分离大鼠颈总动脉，逆行插管到左心室，通过压力换能器记录左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)，左室舒张末压(Left ventricular End-diastolic Pressure，LVEDP)，左室内压最大上升和下降速率(positive and negative peak first derivative,±dp/dtmax)。 1.3.3 心肌细胞凋亡检测

采用原位末端转移酶标记技术，切片常规脱蜡水化，3%H₂O₂ 室温处理后蛋白酶K 37 ℃ 消化 10 min，标记液32 ℃ 标记 2 h，封闭 30 min，生物素化地高辛抗体 37 ℃ 反应 37 min。加生物素化二抗、组织和细胞抗原免疫组化显色试剂(strept actividin-biotin complex，SABC)、3,3-二氨基苯联胺(3,3^-diaminobenzidine，DAB)显色，常规封片，镜下观察，在左心室相应区域不重复随机选取5个高倍视野。 1.3.4 IRE1、ASKl、JNK 蛋白表达检测

采用免疫组化法，石蜡防脱切片60 ℃ 烤片 90 min，常规脱蜡至水洗，热修复抗原，滴加正常羊血清封闭液，滴加1:100稀释一抗，滴加生物素化二抗、SABC、DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。对照用磷酸盐缓冲液代替一抗，采用IPP 6.0分析软件分析切片IRE1、ASKl 、JNK 蛋白表达阳性面积。 1.4 统计分析

所有数据均采用(x±s)表示，使用 SPSS 13.0 软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 芒果苷对糖尿病大鼠血糖含量影响

造模大鼠注射STZ后血糖明显升高，糖尿病组大鼠呈明显多尿、多饮、多食症状，不同程度精神状态差，伴消瘦，2只大鼠未成模，3只大鼠死亡；芒果苷组大鼠一般状态较好，症状较糖尿病组明显减轻；与对照组[(4.81±0.59)mmol/L]比较，糖尿病组大鼠血糖含量[(25.52±2.82)mmol/L]明显升高(t=20.41，P<0.01)；与糖尿病组比较，芒果苷低、中、高剂量组大鼠血糖[分别为(19.86±1.73)、(17.26±1.42)、(12.04±1.86)mmol/L]明显降低(P<0.01)。 2.2 芒果苷对糖尿病大鼠心功能影响(表 1)

与对照组比较，糖尿病组大鼠心功能 LVSP 、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低，LVEDP 升高(P<0.01)；与糖尿病组比较，芒果苷各剂量组大鼠 LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 表现出不同程度升高，LVEDP降低，尤以高剂量组改善最为明显(P<0.01)。

表 1

表 1 芒果苷对糖尿病大鼠心脏功能影响(x±s) 组别(mg/kg) n LVSP(mm Hg) LVEDP(mm Hg) +dp/dtmax(mm Hg/s) -dp/dtmax(mm Hg/s) 对照组 10 116.75±4.56 3.98±0.09 5397.13± 56.98 5089.50±34.40 糖尿病组 8 67.14±6.64a 8.91±0.72a 3920.33±93.46a 3833.17±147.92a 芒果苷 15 9 80.28±6.09b 8.09±1.01 4503.57±94.86b 4300.43±85.81b       30 9 100.91±6.52b 6.85±0.60b 4980.57±72.27b 4816.29±80.14b       60 9 106.52±7.39b 6.20±0.51b 5049.57±104.87b 4899.43±64.25b 注：与对照组比较，a P<0.01；与糖尿病组比较，b P<0.01;1 mm Hg=0.133 kPa。

表 1 芒果苷对糖尿病大鼠心脏功能影响(x±s)

对照组大鼠心肌内偶可见凋亡细胞，属于生理性死亡。对照组，糖尿病组，芒果苷低、中、高剂量组大鼠心肌细胞凋亡率分别为(3.50±0.76)%、(25.63±1.41)%、(19.27±1.53)%、(16.91±1.65)%、(13.22±1.71)%；与对照组比较，糖尿病组大鼠心肌细胞凋亡率明显增加(t=39.16，P<0.01)；与糖尿病组比较，各剂量芒果苷组大鼠心肌细胞凋亡率明显下降(P<0.01)。 2.4 芒果苷对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达影响(表 2)

与对照组比较，糖尿病组大鼠心肌细胞 IRE1、ASKl、JNK 表达均明显升高(P<0.01)；与糖尿病组比较，芒果苷各剂量组大鼠心肌细胞 IRE1、ASKl、JNK 表达不同程度降低，尤以高剂量组降低明显(P<0.01)。

表 2

表 2 芒果苷对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡蛋白表达影响(x±s) 注：与对照组比较，a P<0.01；与糖尿病组比较，b P<0.01。 组别(mg/kg) n IRE1 ASKl JNK 对照组 10 7.86±0.21 15.97±0.79 3.59±0.51 糖尿病组 8 41.19±1.34a 35.78±0.85a 38.74±4.00a 芒果苷 15 9 37.81±1.10b 26.67±1.56b 26.91±1.64b              30 9 35.38±0.75b 22.93±0.86b 21.43±0.84b              60 9 29.72±2.01b 19.63±0.84b 14.39±1.98b

表 2 芒果苷对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡蛋白表达影响(x±s)

糖尿病患者70％以上死于心血管系统疾病，是非糖尿病人群心血管系统疾病病死率的2～3倍。糖尿病及其并发症与多种传统心血管病危险因素之间存在复杂联系^[1]。DCM 可以造成细胞代谢异常，进而损伤线粒体、内质网等细胞器，增加细胞肥大和凋亡，细胞凋亡是指细胞由多种因素造成的按一定程序进行的细胞自发式死亡^[2]，心肌细胞凋亡在 DCM 中起重要作用。当各种细胞外应激因素(如缺血、缺氧、细胞因子等)^[3]存在时，活化的IRE1与肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)相连，其复合物结合 ASK1 将激活 JNK 信号通路诱导细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组比较，糖尿病组大鼠心脏 LVSP、±dp/dtmax 明显降低，LVEDP 明显升高，提示糖尿病组大鼠存在心肌收缩和舒张功能不全，芒果苷干预12周后心脏功能得到明显改善。

ERS 通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)诱导细胞凋亡，导致心肌出现持久的炎症病变，构成DCM的病变基础。UPR进一步激活内质网应激伴随分子 IRE1，可减少蛋白的错误折叠以修复自身。在 ERS 中的 JNK 通路中，ASKl 与 IRE1α 共同形成 IRE1-TRAF2-ASK1 复合物^[4]，适当的 ERS可减少未折叠蛋白反应，但持续或严重的 ERS 即诱发凋亡信号通路，导致细胞凋亡和心肌损伤^[5]。ERS 状态时，通过活化的 IRElα 与 TRAF2 结合激活 ASKl，而 ASK1 进一步激活 JNK 磷酸化为 p-JNK从而引起细胞凋亡^{[6, 7]}。在这条信号通路中，ASK1 对于激活JNK和诱导细胞凋亡是必不可少的，在去除了 ASK1 的小鼠中，ERS 不能激活 JNK 及诱导细胞凋亡。JNK 属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族亚族，MAPK 在细胞增殖、分化和凋亡中起着重要作用，被外界因素激活后介导应激反应。在过度凋亡存在时，出现JNK的过度激活，当抑制 JNK 后，可减少凋亡细胞的数目。本研究结果显示，给予芒果苷干预12周后，可明显降低心肌细胞凋亡发生率，减轻凋亡所致心肌损伤程度，使心功能得到改善，其机制可能与芒果苷降低心肌细胞 IRE1、ASKl、JNK 蛋白表达有关。