中国公共卫生  2015, Vol. 31 Issue (4): 441-443   PDF    
引用本文
张帆, 王素萍, 高向东, 邬惟为, 董洁敏. TLR2及其相关细胞因子在军团菌感染中作用[J]. 中国公共卫生, 2015, 31(4): 441-443.
ZHANG Fan, WANG Su-ping, GAO Xiang-dong, et al. Role of TLR2 and its related cytokines in Legionella infection[J]. Chinese Journal of Public Health, 2015, 31(4): 441-443.
TLR2及其相关细胞因子在军团菌感染中作用
张帆, 王素萍 , 高向东, 邬惟为, 董洁敏    
山西医科大学公共卫生学院流行病学教研室, 山西 太原 030001
数字出版日期：2015-3-16 11:09.
基金项目：国家自然科学基金(30872154);高等学校博士学科点专项科研基金(20040114004)
作者简介：张帆(1971-),女,山西太原人,副教授,博士,研究方向:感染免疫.
通讯联系人：王素萍,E-mail:spwang88@163.com
摘要：目的 通过体外实验探讨Toll样受体2(TLR2)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)在军团菌感染中的作用.方法 分离30名健康人外周血单核细胞(PBMC),将每名健康人PBMC分为对照组和军团菌刺激组,军团菌刺激组加入500 μL 2×107/mL军团菌悬液,对照组加入500 μL磷酸盐缓冲液(PBS),分别在18、24、72 h时获取细胞及上清液,采用real-time PCR法测定细胞中TLR2、MyD88 mRNA的表达水平,ELISA法检测细胞培养上清液IL-6、IL-1β及TNF-α含量.结果 与对照组比较,18h军团菌刺激组MyD88 mRNA △Ct值(1.414 0±0.044 9)低于对照组(1.684 4±0.042 6),24h军团菌刺激组TLR2 mRNA△Ct值(1.347 9±0.056 2)低于对照组(1.425 9±0.038 7),72h军团菌刺激组TLR2 mRNA和MyD88 mRNA △Ct值 [(1.504 9±0.018 9)和(1.540 0±0.031 9)]均高于对照组[(1.410 5±0.025 5)和(1.339 2±0.032 2)],差异均有统计学意义(均P< 0.05);18、24、72h军团菌刺激组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均高于对照组,差异均有统计学意义(均P< 0.05).结论 TLR2及TNF-α、IL-1β、IL-6等相关炎性因子可有效抵制军团菌感染,TLR2介导的天然免疫可能是军团菌感染的保护因素.
关键词： Toll样受体2(TLR2)     肿瘤坏死因子-α(TNF-α)     白介素1β(IL-1β)     白介素6(IL-6)     军团菌     感染    
Role of TLR2 and its related cytokines in Legionella infection
ZHANG Fan, WANG Su-ping , GAO Xiang-dong, et al    
Department of Epidemiology, School of Public Health, Shanxi Medical University, Taiyuan, Shanxi Province 030001, China.
Abstract: Objective To explore the role of Toll like receptor 2(TLR2) and its related cytokines in Legionella infection by in vitro experiment.Methods Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) were obtained from healthy subjects(n=30) and were stimulated with live Legionella pneumophila(Lp) for 18,24,and 72 hours.The mRNA expression levels of TLR2 and myeloid differentiation factor 88(MyD88) in PBMCs were determined using real-time reverse transeription PCR(RT-PCR).The expression levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-1β(IL-1β),and interleukin-6(IL-6) were measured with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results TLR2 mRNA expression level was not significantly different between stimulation group and control group in 18 hours(P >0.05).TLR2 mRNA expression level of stimulation group was significantly higher than that of control group(1.3479±0.0562 vs.1.4259±0.0387,P <0.05) in 24 hours.The MyD88 mRNA expression level of stimulation group was significantly higher than that of control group(1.4140±0.0449 vs.1.6844±0.0426,P <0.05) in 18 hours.The MyD88 mRNA expression level was not statistically significantly different between stimulation group and control group in 24 hours(P >0.05).TLR2 mRNA and MyD88 mRNA expression levels of stimulation group were significantly lower than those of control group(P <0.05) in 72 hours.The concentration of TNF-α,IL-1β and IL-6 for Legionella stimulation group were significantly higher than those of the control group(P <0.05) in 18,24 and 72 hours.Conclusion Our study showed that TLR2 and its related inflammatory cytokines TNF-α,IL-1β and IL-6 can effectively resist Legionella infection and TLR2 mediated innate immunity may be a protective factor for Legionella infection.
Key words: Toll like receptor 2     TNF-α     IL-1β     IL-6     Legionella pneumophila     infection    

军团菌病是1976年发现的以群体发热及非典型肺炎为基本特征的急性呼吸道传染病。嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,LP)是引起非典型肺炎的重要病原菌[1]。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)可识别并结合不同细菌或病毒的分子结构，启动机体天然免疫清除病原微生物[2]。TLR识别配体后通过髓样细胞分化蛋白MyD88依赖性途径向胞内传递信号，产生炎症因子如白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 等激活天然免疫系统[3]。研究发现MyD88缺陷的小鼠丧失了对TLR配体的反应能力，表明MyD88在TLR信号传导中的作用非常重要[4]。目前TLR在军团菌天然免疫中的作用还未明确，本研究通过体外实验分析军团菌刺激健康人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)后TLR2及其相关细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的表达，初步探讨TLR2在识别和清除军团菌中的作用。 1 材料与方法 1.1 材料

PBMC分离自山西省太原市红十字血液中心提供的30名健康人外周血；嗜肺军团菌血清1型ATCC 33152购自美国标准菌种保藏所。 1.2 主要试剂

人淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)；改良型RPMI-1640培养基(美国Thermo公司);RNAisoTM Plus总RNA提取试剂(TaKaRa D9108A宝生物大连有限公司)；二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate，DEPC)(美国Sigma公司)；RT-PCR一步法试剂盒(TaKaRa DRRO86A宝生物大连有限公司)；ELISA试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。 1.3 菌种复苏

从-80 ℃低温冰箱将军团菌取出，用无菌环挑取菌落，接种于军团菌BCYE培养基，37 ℃、5% CO2培养3~4d，可观察到军团菌的灰白色菌落。用磷酸盐缓冲液(Phosphate bufferred saline,PBS)制备军团菌悬液，在A600的条件下测定军团菌的浓度。 1.4 外周血单核细胞分离及军团菌处理

用密度梯度离心法分离健康人PBMC，台盼兰染色计数活细胞数，以每孔2×106个细胞接种于24孔板，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。将每名健康人PBMC分为对照组和军团菌刺激组，军团菌刺激组加入500 μL 2×107/mL军团菌悬液，对照组加入500 μL PBS。孵育2h待军团菌进入贴壁细胞后，弃上清，用1mL PBS溶液清洗后，加入1mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液继续培养。分别在24、48、72 h时收获细胞及上清液用于后续实验，2组分别做复孔。 1.5 Real-time PCR技术检测细胞中的TLR2 mRNA和MyD88 mRNA的表达水平

参照RNAiso TM Plus试剂盒说明书提取细胞总RNA，按一步法RT-PCR 试剂盒说明书进行操作。PCR引物由大连宝生物工程有限公司设计并合成。TLR2上游引物:5′-GGAGCATCCGAATTGCATCAC-3′,下游引物：5′-TTATGGCCACCAAGATCCAGAAG-3′;MyD88上游引物:5′-AAGATGACCCTGGGAGCCCTA-3′,下游引物5′-GCTCAGGCCAGTCATCATTGAA-3′;β-actin上游引物:5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,下游引物：5′-TTGCTGTTGAAGTCGAGGAG-3′。PCR反应体系为25 μL。Real time PCR反应条件：反转录反应42 ℃ 5min，95 ℃ 10 s，PCR反应条件95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s，循环40次；绘制溶解曲线 95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，95 ℃ 15 s。荧光信号由本底进入指数增长阶段达到荧光阈值所对应的循环数称为Ct值，用△Ct=Ct样品/Ct β-actin反应每个样品中mRNA的相对表达水平,此值越大，表示其mRNA表达越少。TLR2扩增片段116 bp，MyD88扩增片段131 bp，β-actin扩增片段150 bp。 1.6 ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量

按照ELISA说明书步骤分别检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。 1.7 统计分析

数据以x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行方差分析、t检验和秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 不同组别TLR2 mRNA及MyD88 mRNA表达比较(表 1)

与对照组比较，18h军团菌刺激组MyD88 mRNA和24h军团菌刺激组TLR2 mRNA △Ct值均低于对照组(均P<0.05)；72h军团菌刺激组TLR2 mRNA和MyD88 mRNA △Ct值均高于对照组(均P<0.05)。

表 1 不同组别TLR2 mRNA及MyD88 mRNA表达比较
2.2 不同组别TNF-α、IL-1β、IL-6浓度比较(表 2)

与对照组别比较，18、24、72h军团菌刺激组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均高于对照组,差异均有统计学意义(<0.05)。

表 2 不同组别TNF-α、IL-1β、IL-6浓度比较
3 讨 论

军团菌肺炎在非典型肺炎中是病情最重的一种，一般人群病死率为1%～25%，医院感染病例可高达30%～50%[5]。WHO 已将其列入传染病报告范围，其生物危害和社会危害大，是防制突发公共卫生事件不可忽视的重要问题。LP是胞内菌，常通过气溶胶感染人群，侵犯肺泡上皮细胞及巨噬细胞并在其中增殖最终导致机体感染。目前利用TLR基因缺失的小鼠模型来研究TLR与军团菌感染关系中最多的是TLR2、TLR4、TLR5和TLR9[6, 7]。本研究通过体外实验用军团菌刺激人PBMC，测定TLR2及其重要的信号转导分子MyD88的表达，结果显示18h军团菌刺激组MyD88 mRNA及24h 军团菌刺激组TLR2 mRNA△Ct值在均低于对照组，提示TLR2 及 MyD88 的mRNA表达量在一定时间内高于对照组，初步说明TLR2及其信号转导分子MyD88参与了军团菌的天然免疫过程。Girard等[8]发现军团菌LPS具有独特的结构如脂肪酸链的长度、缺少负电荷、具有疏水的外核等，其内毒素活性较大肠埃希菌LPS弱。TLR4并不是能够识别所有的革兰阴性菌，由于军团菌LPS的特殊疏水性，使其与TLR4的结合较差，而主要被TLR2所识别。TLR2活化后可产生一系列炎性细胞因子从而激活天然免疫系统，杀伤入侵病原微生物。TNF-α、IL-1β、IL-6均是由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应。国内外人群研究均发现嗜肺军团感染者IL-6、TNF-α、IL-8和IL-10的水平明显升高[9, 10]。本研究通过体外实验发现军团菌刺激组TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度在18、24和72h均高于对照组，提示当TLR2识别并且结合军团菌后，会激活MyD88依赖的信号转导通路产生相应细胞因子，参与军团菌的清除。本研究通过体外实验用军团菌刺激健康人PBMC，模拟体内的感染过程，结果发现军团菌能够在一定时间范围内诱导细胞TLR2及MyD88表达和相关细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平的升高，从而有效抵制军团菌感染，提示TLR2介导的天然免疫可能是军团菌感染的保护因素，可为今后的研究提供有益的参考。

参考文献
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