肿瘤的生长和转移是一个复杂的多步骤过程，其可以穿过基底膜进入血管系统，随循环系统扩散，在继发组织器官定位生长，转移和继续扩散等^[1]；而氨肽酶N在肿瘤细胞的演进过程中的各个环节都起到了一定的作用，如参与细胞基质的降解和心血管的生成^{[2, 3, 4, 5]}，降解胸腺肽和白介素等，为肿瘤细胞的生长提供了便利条件，这意味着氨肽酶N抑制剂可以有效的抑制肿瘤细胞的生长和转移。木犀草素是黄酮类化合物^[6]，具有抗诱变、抗肿瘤、抗感染、抗过敏等药理活性，研究表明，木犀草素还具有抑制恶性肿瘤细胞和抑制人肥大细胞活化的作用^[7]。本课题将以木犀草素为目标药物研究对象，通过木犀草素对氨肽酶N的抑制作用机理进行研究，分析木犀草素对氨肽酶N抑制作用类型和抑制动力学常数，探讨木犀草素与氨肽酶N的相互作用机制，并进一步对氨肽酶N构象的影响进行研究，以探讨其抗癌作用是否与其对氨肽酶N的抑制作用有关。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料

脑胶质瘤U87细胞系(首都医科大学药理实验室)，细胞置于RPMI 1640完全培养基中，在 37 ℃、5%CO₂，95%湿度培养箱中培养，细胞单层贴壁生长，每2 d更换1次培养基，细胞每周按1:3传代；木犀草素、溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑[3-bromide(4,5-two-2)-2,5-two phenyl methyl thiazolyl tetrazolium，MTT]、二甲基亚砜、氨肽酶N、L-亮氨酞-P-硝基苯胺、贝他定(美国 Sigma 公司)；UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。 1.2 方法 1.2.1 木犀草素对氨肽酶N的抑制作用

氨肽酶N催化底物(L-亮氨酞-p-硝基苯胺)产生对-硝基苯胺，在405 nm有紫外吸收，对-硝基苯胺的浓度与酶活性的大小呈正相关；通过检测405 nm处的吸收值得变化，来确定氨肽酶N的活性，以能够间接的反映出抑制剂对酶活性抑制程度的大小^[8]。木犀草素和氨肽酶N在37 ℃下，pH 6.8的磷酸盐(50 mmol)缓冲体系中下孵化3 h后，加入L-亮氨酞-P-硝基苯胺，利用UV-2450型紫外-可见分光光度计的动力学/时间软件测定405 nm处吸光值的变化，并通过通过关系式：相对活性(%)=(R/R₀)×100%，计算木犀草素对氨肽酶N的抑制活性；式中R₀为无抑制剂时的吸光度变化的斜率，R为在含有不同浓度木犀草素(0~250 μmol)的体系中的吸光度变化的斜率。以贝他定为阳性对照，平行3次实验(n=3)用UV-2450型紫外-可见分光光度计的动力学/时间软件测定405 nm处吸光值的变化，并通过通过关系式：相对活性(%)=(R/R₀)×100%，计算木犀草素对氨肽酶N的抑制活性；式中R₀为无抑制剂时的吸光度变化的斜率，R为在含有不同浓度木犀草素(0~250 μmol)的体系中的吸光度变化的斜率。以贝他定为阳性对照，平行3次实验(n=3)，c(氨肽酶N)=4 μg/mL,c(L-亮氨酞-P-硝基苯胺)=1.0 mmol。 1.2.2 木犀草素对氨肽酶N的抑制动力学研究

在37 ℃，相同的缓冲体系中，固定氨肽酶N的浓度4 μg/mL)，测定在不同底物浓度下的酶促反应速度，采取Lineweaver-Burk作图，根据酶促反应的表观米氏常数(K_mapp)和最大反应速率(V_max)的变化分析木犀草素对氨肽酶N的抑制动力学，并求得木犀草素(0、25、50、100 μmol)对氨肽酶N的抑制常数K_i，平行3次实验(n=3)。 1.2.3 木犀草素对脑胶质瘤U87细胞生长抑制试验

以bestatin为阳性对照，以不加木犀草素为空白对照，把不同浓度的木犀草素(0～200 μmol)和人脑胶质瘤U87细胞，在37 ℃，5%CO₂中孵育48 h，之后加入0.5%的MTT染色液，继续孵育4 h后，2 500 r/min，离心30 min，弃培养基，加入二甲基亚砜溶液，利用UV-2450型紫外-可见分光光度计测定570 nm处的吸光值(A值)，细胞生长抑制率按下式计算:抑制率(%)=(空白A值-抑制剂A值/空白A值)×100%，平行3次实验(n=3)。 1.3 统计分析

所有实验测定均重复3次(n=3)，采用SPSS 13.0 统计软件进行数据处理，结果以x±s表示。 2 结 果 2.1 木犀草素对氨肽酶N活性的抑制作用(表 1、图 1)

从表 1可以看出，当木犀草素与贝他定为5 μmol时，二者对酶活性的抑制，差异无统计学意义，但随着抑制剂木犀草素浓度的增加，氨肽酶N的活性在不断的下降(P<0.05)，直到木犀草素的浓度达到150 μmol后，氨肽酶N的相对活性的趋于平缓，解析其半数抑制浓度(IC₅₀)为(70.85±2.05)μmol，与阳性对照bestatin的IC₅₀为(21.23±0.45)μmol相比，木犀草素对氨肽酶N显示出了一定的抑制作用。图 1显示了氨肽酶N的活性与加入的酶量之间的关系，在不同浓度的木犀草素(曲线由上到下:0、25、75、150 μmol)的测活体系中，固定底物的浓度，不断地改变酶的浓度，酶催化活力对酶浓度作图得到一组通过原点的直线，且随着木犀草素浓度的增加，每条直线的斜率不断降低。

表 1

表 1 木犀草素对氨肽酶N的抑制作用 浓度(μmol) 木犀草素(%) 贝他定(%) t值 P值 5 95.54± 6.57 95.53± 5.48 8.32 0.221 10 83.33± 6.13 64.98± 5.38 2.11 0.012 20 73.56± 5.41 50.58± 5.46 3.08 0.035 30 65.84± 4.38 40.26± 4.44 4.12 0.032 40 59.45± 4.97 32.43± 3.92 3.34 0.011 50 54.23± 4.54 26.82± 3.23 3.11 0.021 75 46.65± 2.28 21.63± 3.33 3.04 0.009 100 38.74± 3.25 16.32± 2.56 2.12 0.011 150 29.89± 3.31 7.93± 1.34 1.65 0.031 200 25.11± 3.31 3.11± 0.46 2.54 0.021 250 22.13±3.03 1.54± 0.16 1.99 0.022

表 1 木犀草素对氨肽酶N的抑制作用

图 1

图 1 木犀草素对氨肽酶N的抑制类型

在相同的缓冲体系下，从起始孵化时间3 min 开始，每隔180 s从不同浓度的木犀草素-酶中取出相同体积的孵化液后，加入底物L-亮氨酞-P-硝基苯胺，测定氨肽酶N的相对活性；从表 2可以看出，在不同的木犀草素浓度下，随着孵化时间的增加，在不同浓度的木犀草素孵化下，氨肽酶N的相对活性木发生变化，差异无统计学意义(P>0.05)。

表 2

表 2 木犀草素对氨肽酶N抑制时间进程 时间(min) 木犀草素(25 μmol) 木犀草素(50 μmol) 木犀草素(75 μmol) 木犀草素(100 μmol) 3 82.35± 6.43 63.07± 5.55 42.19± 3.22 33.33± 2.11 6 81.03± 6.32 63.56± 3.99 41.69± 4.33 32.83± 4.43 9 80.75± 5.57 64.67± 4.43 41.72± 3.09 32.67± 5.57 12 80.47± 7.12 63.33± 5.76 41.16± 4.98 33.43± 1.57 15 80.47± 6.01 64.89± 2.22 41.19± 3.89 32.33± 6.98 18 80.79± 4.58 62.87± 4.56 40.69± 4.87 32.67± 3.58 21 79.83± 7.01 63.45± 4.89 41.70± 4.87 32.01± 3.56 24 79.83± 3.65 64.65± 6.77 41.69± 3.89 33.33± 4.57 27 79.43± 4.66 63.56± 4.76 41.70± 4.32 31.33± 1.57 30 80.97± 5.54 64.09± 5.67 40.67± 5.65 30.67± 3.43 40 80.15± 4.65 63.23± 5.11 41.19± 3.21 32.67± 2.76 50 80.19± 6.99 64.56± 4.12 42.72± 2.76 32.98± 3.21 60 79.63± 6.11 61.76± 6.22 42.21± 6.57 31.33± 4.76 90 80.43± 6.42 63.76± 6.57 40.67± 6.43 30.87± 2.76 120 80.15± 6.09 62.87± 5.43 40.67± 3.38 30.67± 3.87 t值 2.894 3.421 1.785 0.765 P值 0.987 0.664 0.753 0.598

表 2 木犀草素对氨肽酶N抑制时间进程

进一步验证木犀草素对氨肽酶N的抑制作用类型，在相同实验条件下，固定酶的浓度，在不同底物浓度下，木犀草素对多酚氧化酶抑制作用，分析木犀草素对氨肽酶N的抑制动力学，并利用Lineweaver-Burk双倒数方程作图(图 2)，得出木犀草素对氨肽酶N的抑制作用类型为竞争型抑制作用，并求得抑制常数K_i=(24.83±0.14)μmol。

图 2

图 2 木犀草素抑制氨肽酶N的Lineweaver-Burk曲线

从表 3中可以看出，随着木犀草素和bestatin浓度的不断增加，对脑胶质瘤U87细胞生长的抑制作用在不断地增强，相同浓度下的木犀草素和bestatin的抑制效果差异无统计学意义(P>0.05)；分别计算阳性对照bestatin和木犀草素对脑胶质瘤U87细胞生长的半抑制浓度IC₅₀为(49.34± 1.22)和(61.23± 2.13)μmol，显示木犀草素抑制脑胶质瘤U87细胞的生长的能力稍低于bestatin，这与酶抑制作用实验结果一致，表明木犀草素可能是由于对氨肽酶N活性的抑制，诱导了脑胶质瘤U87细胞的凋亡。

表 3

表 3 木犀草素对脑胶质瘤U87细胞生长的抑制作用 浓度(μmol) 木犀草素(%) 贝他定(%) t值 P值 5 4.54±0.53 6.53±0.21 8.32 0.143 10 7.33±1.22 10.98±2.58 7.11 0.053 20 16.56±1.41 20.58±3.44 7.08 0.076 30 23.84±2.34 28.26±3.49 6.12 0.087 40 32.45±3.67 40.43±4.12 5.39 0.231 50 42.23±3.33 48.82±5.20 8.01 0.321 75 55.65±4.28 57.63±5.87 7.09 0.209 100 69.74±5.55 64.32±4.87 6.87 0.430 150 77.89±6.09 73.93±6.32 5.87 0.563 200 83.11±7.87 78.11±5.33 11.21 0.765

表 3 木犀草素对脑胶质瘤U87细胞生长的抑制作用

可逆性实验表明，增加木犀草素的浓度使氨肽酶N活力受到抑制，而不是通过减少有效酶量引起酶活力下降。这意味着木犀草素对氨肽酶N的抑制作用类型属于可逆的过程^[9]。木犀草素对氨肽酶N活性的影响表明，木犀草素对氨肽酶N的抑制作用是具有浓度依赖性，酶抑制时间动力学发现木犀草素能轻松的与氨肽酶N发生相互作用，并快速的改变酶的生理结构和性质，最终使酶在短时间内得到抑制，且相对活性不再随着孵化时间发生变化^[10]。Lineweaver-Burk双倒数图是相交于纵坐标的一组直线，是用以计算酶抑制类型的经典公式，结果主要体现在V_max和K_mapp变化，若体系中V_max保持不变，而K_mapp逐渐增大，则是典型的竞争性抑制作用类型^[11]；若体系中K_mapp保持不变，而V_max逐渐增大，是典型的非竞争性抑制作用类型；若体系中V_max和K_mapp随着抑制剂浓度的增加均发生改变，那么这是典型的混合型抑制作用类型；本研究中发现木犀草素是典型的竞争性抑制剂，表明木犀草素可能会结合到氨肽酶N的活性中心，与底物竞争活性位点，从而达到抑制的效果。

氨肽酶N是bestatin主要的作用靶点，bestatin可诱导脑胶质瘤U87细胞的凋亡，本研究以人脑胶质瘤U87细胞为靶细胞，研究木犀草素素对脑胶质瘤U87细胞生长的抑制作用；方法原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够还原黄色的MTT为蓝紫色的不溶于水的甲瓒，并沉积在细胞中，甲攒的生成量在通常情况下与活细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比；甲瓒能被二甲基亚砜溶解，其含量可在570 nm处的测定吸收值来确定，因此可根据570 nm 处的测定吸收值的变化，间接推测出活细胞的数目，并了解抑制剂杀伤肿瘤细胞的能力^{[12, 13]}。结果表明，木犀草素对脑胶质瘤U87细胞生长的抑制活性与体外抑酶实验的趋势相一致，即随着木犀草素浓度的增大，对脑胶质瘤U87细胞生长的抑制作用明显增加。

综上所述，木犀草素是一种可逆的竞争型氨肽酶N抑制剂，能快速与氨肽酶N发生作用并迅速降低酶的活性，进而诱导了脑胶质瘤U87细胞的凋亡。