不同诱因导致的急慢性肝病，如病毒性肝炎、药物性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝病等，均能造成肝细胞损伤。而肝细胞损伤是肝病的共同病理基础^[1]。因此，建立一种可靠、稳定的肝细胞损伤模型，有利于开展肝细胞损伤机制的研究，有助于大量筛选保肝药物。在多种肝病的肝细胞损伤中氧化应激是一个重要的损伤机制^[2]。氧化应激是指细胞暴露于活性氧而引起的细胞损伤^[3]。氧化应激水平的提高能够损伤细胞甚至导致细胞死亡，最终导致诸如炎症、癌症等疾病的发生和发展^{[3, 4]}。过氧化氢(H₂O₂)是一类活性氧，极易透过细胞膜对细胞造成损伤。在适宜浓度的H₂O₂诱导下，细胞DNA被损伤，相关的基因表达发生变化，细胞内蛋白质和脂质进而被损伤，但这种损伤不会造成细胞死亡，而且在适宜的保护剂作用下，这些损伤还有可能被修复。本研究拟以H₂O₂作用于体外培养的肝癌细胞株(HepG2)及正常肝细胞株(Chang liver)，建立肝细胞氧化损伤模型，通过观察上清液中肝损伤指标酶以及肝细胞内抗氧化指标变化，比较H₂O₂诱导的2种体外肝细胞损伤模型，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

人HepG2和Chang liver细胞(南京凯基生物有限公司)；Dulbecco′s minimum essential medium(DMEM)培养基及胎牛血清(美国Gibco公司)；噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)(美国Sigma公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdelyde,MDA)及蛋白质试剂盒(南京建成科技有限公司)。3-30K型离心机(美国Sigma公司)；S22PC型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；RT-2100型酶标仪(深圳雷杜公司)。 1.2 指标与方法 1.2.1 细胞培养

HepG2和Chang liver细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、5%CO₂、饱和湿度条件下静置培养，细胞铺满瓶底80%以上，取对数生长期细胞进行实验。 1.2.2 细胞生长抑制率检测

采用噻唑蓝法，肝细胞接种于96孔板中，24 h后用于实验，模型组加入H₂O₂使其质量浓度分别为75、150、300、600、1 200 μmol/L，另设对照组，每孔做6个平行孔；H₂O₂作用2 h后，噻唑蓝法检测细胞生长抑制率，并确定H₂O₂的最佳浓度，重复测定3次。取另一组细胞接种于96孔板中，以最佳浓度的H₂O₂分别作用细胞0.5、1、2、4、12和24 h，噻唑蓝法测定细胞生长抑制率，并确定H₂O₂的最佳时间；每孔做6个平行孔，重复3次。 1.2.3 培养液中LDH、ALT、AST活性检测

细胞处理在6孔板内进行，2种细胞分别用300 μmol/L H₂O₂处理4 h后，收集培养液，按试剂盒说明书测定培养液中LDH、ALT、AST活性；实验重复3次。 1.2.4 细胞内SOD、GSH、MDA测定

细胞处理在6孔板内进行，用300 μmol/L H₂O₂损伤细胞4 h后，用胰酶消化，收集并破碎细胞，离心取上清，按试剂盒说明书步骤测定SOD、GSH、MDA含量，实验重复3次。 1.3 统计分析

数据以x±s表示，采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，组间均数比较采用单因素方差分析和Turkey′s多因素t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 H₂O₂对2种肝细胞生长抑制率影响(图 1)

结果表明，与对照组比较，75～1 200 μmol/L H₂O₂作用于HepG2和Chang liver细胞2 h后，细胞生长抑制率明显增高，且呈现浓度依赖性(P<0.05)；过氧化氢浓度为300 μmol/L时，HepG2和Chang liver细胞生长抑制率分别为49%和59%；提示两种细胞系均可用于氧化应激模型的建立，但Chang liver细胞较HepG2细胞对H₂O₂更为敏感；后续实验选择300 μmol/L H₂O₂作为细胞氧化应激损伤的最佳浓度。

图 1

图 1 不同浓度H2O2对2种肝细胞生长抑制率影响

H₂O₂作用时间为0.5~4 h时，细胞生长抑制率随时间增加而升高(P<0.05)，4 h后细胞生长抑制率基本达到平台期。考虑到作用时间过长，细胞可能出现不可逆的损伤甚至死亡，因此，选择300 μmol/L H₂O₂处理4 h作为后续研究H₂O₂诱导HepG2和Chang liver损伤的最佳条件。此条件下，细胞生长抑制率分别为62%和76%，与HepG2细胞比较，Chang liver细胞仍然显示更高的敏感性。

图 2

图 2 H2O2作用时间与肝细胞生长抑制率关系

300 μmol/L H₂O₂作用于HepG2和Chang liver细胞4 h后，与对照组比较，2种细胞培养液中ALT、AST、LDH活性均明显升高(P<0.05)，提示2种细胞系的氧化应激损伤模型均建立成功。

表 1

表 1 H2O2对2种肝细胞培养液中ALT、AST、LDH活性影响(U/L，x±s,n=6) 组别 ALT AST LDH HepG2 Chang liver HepG2 Chang liver HepG2 Chang liver 对照组 8.9±0.1 4.8±0.1 14.6±3.1 6.2±1.1 159.2±13.5 140.8±10.5 模型组 18.2±0.2a 19.1±0.1a 34.2±4.6a 30.3±2.5a 544.2±26.8a 536.8±22.3a 注：与对照组比较，a P<0.05.

表 1 H2O2对2种肝细胞培养液中ALT、AST、LDH活性影响(U/L，x±s,n=6)

与对照组比较，2种细胞中MDA含量明显升高，GSH含量和SOD活性明显降低(P<0.05)；提示2种细胞系的氧化应激模型均建立成功。Chang liver细胞中MDA含量高于HepG2细胞，进一步证实Chang liver细胞较HepG2细胞对氧化应激损伤更为敏感。

表 2

表 2 H2O2对2种肝细胞MDA、GSH和SOD水平影响(x±s,n=6) 组别 MDA(nmol/mgprot) GSH(nmol/mgprot) SOD(U/mgprot) HepG2 Chang liver HepG2 Chang liver HepG2 Chang liver 对照组 5.3±1.0 3.3±0.5 9.8±1.1 12.3±1.7 247.3±14.0 338.1±14.4 模型组 7.8±0.9a 8.6±1.1a 4.2±0.8a 6.9±1.0a 133.4±6.3a 163.0±6.1a 注：与对照组比较，a P<0.05.

表 2 H2O2对2种肝细胞MDA、GSH和SOD水平影响(x±s,n=6)

氧化损伤可由体内活性氧产生过多和(或)抗氧化物质如GSH水平下降而产生^{[5, 6]}。细胞受到H₂O₂损伤后，细胞内生成大量活性自由基，引发细胞膜上脂质过氧化反应，生成终产物MDA；并且大量损耗细胞内源性抗氧化剂如GSH等，破坏细胞内氧化与抗氧化平衡，使细胞处于氧化应激状态^{[5, 6, 7, 8]}。同时，受损的肝细胞膜通透性增强，胞内酶如转氨酶等大量释放至培养液^{[9, 10]}。因此，除噻唑蓝法检测细胞生长抑制率外，培养液中ALT、AST和LDH活性检测亦有助于确认模型的构建是否成功，特别是细胞抗氧化活力的变化可更准确地描述氧化损伤模型的功能^{[4, 9, 10, 11]}。本研究结果表明，用300 μmol/L H₂O₂处理HepG2和Chang liver细胞4 h后，细胞生长抑制率为60%~70%，其损伤程度可用于肝损伤细胞模型中保护措施效果的判断。在培养基中加入H₂O₂是制作短期氧化损伤模型的常用方法，但H₂O₂浓度会迅速下降，影响长期氧化应激模型的稳定性。由于4 h是评价基因表达和相关蛋白产物最小的共有时间间隔^[3]，考虑到长时间作用也会对细胞造成不可逆损伤甚至死亡，因此作用时间选择为4 h。但具体实验中针对不同研究目的，H₂O₂作用时间可以适当缩短或延长。本研究结果显示，因H₂O₂所致Chang liver细胞生长抑制率变化比HepG2细胞更敏感，但其他指标尚无一致性结论。具体机制值得进一步深入研究。