中国公共卫生  2015, Vol. 31 Issue (3): 318-320   PDF    
引用本文
金连海, 朱洁, 张宸豪, 张慧锋, 赵文秀. 雌马酚对血管内皮细胞凋亡和增殖影响[J]. 中国公共卫生, 2015, 31(3): 318-320.
JIN Lian-hai, ZHU Jie, ZHANG Chen-hao, et al. Impact of equol on apoptosis and proliferation of vascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2015, 31(3): 318-320.
雌马酚对血管内皮细胞凋亡和增殖影响
金连海1, 朱洁2, 张宸豪2, 张慧锋3, 赵文秀3     
1. 吉林医药学院心理学教研室, 吉林 吉林 132013;
2. 吉林医药学院检验学院;
3. 吉林医药学院药学院
数字出版日期：2015-2-15 10:14.
基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2012335);国家自然科学基金(82102953);吉林省科技厅中青年科技创新领军人才及团队项目(20130521018JH);吉林省科技厅科技攻关重大项目(20140203012YY)
作者简介：金连海(1972-),男,黑龙江牡丹江人,副教授,硕士,研究方向:医学行为学。
通讯联系人：赵文秀,E-mail:wenxiu7201@163.com
摘要：目的 探讨大豆异黄酮(SI)代谢物雌马酚对血管内皮细胞凋亡和增殖的影响。方法 体外培养血管内皮细胞(ECV-304),采用不同浓度雌马酚(0、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μmol/L)处理24 h, 收集细胞, 采用流式细胞术分析细胞内活性氧(ROS)、细胞凋亡和细胞周期;采用免疫组织化学技术分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3表达;采用噻唑蓝(MTT)法分析雌马酚对ECV-304细胞增殖影响。结果 与对照组比较, 6.25 μmol/L雌马酚组ECV-304细胞内ROS含量下降, 100.00 μmol/L雌马酚组ECV-304细胞内ROS含量升高;与对照组比较, 25.00、50.00、100.00 μmol/L雌马酚组ECV-304细胞早、晚期凋亡率明显升高, 并可导致细胞G1期阻滞(P<0.05);MTT实验结果显示, 0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L雌马酚组ECV-304细胞增殖抑制率分别为-(8.23±2.21)%、-(3.29±1.07)%、(6.75±1.73)%、(25.46±4.82)%和(36.93±4.66)%, 低剂量雌马酚对细胞生长具有促进作用, 高剂量雌马酚对细胞生长具有抑制作用;与对照组比较, 25.00 μmol/L雌马酚组作用24 h后, 细胞内Bax和caspase-3表达增加, 而Bcl-2表达减少。结论 低浓度雌马酚可降低细胞内ROS含量, 促进ECV-304细胞增殖;高浓度雌马酚可导致细胞凋亡、细胞周期阻滞, 抑制细胞增殖。
关键词： 血管内皮细胞(ECV-304)     细胞凋亡     增殖抑制     雌马酚    
Impact of equol on apoptosis and proliferation of vascular endothelial cells
JIN Lian-hai1, ZHU Jie2, ZHANG Chen-hao2, et al    
Psychology Department, Jilin Medical College, Jilin, Jilin Province 132013, China
Abstract: Objective To study the effect of equol(Eq),a metabolite of soybean isoflavones,on apoptosis and proliferation of vascular endothelial cells.Methods Vascular endothelial cells(ECV-304)were cultured in vitro and treated with different concentrations of Eq (0, 6.25,12.5,25,50,and 100 μmol/L) for 24 hours and then the cells were collected.Reactive oxygen species(ROS),apoptosis and cell cycle were determined with flow cytometry.Apoptosis-related proteins(Bax,Bcl-2,and caspase-3)were detected with immunohistochemical method.Eq-related cell proliferation inhibition rate(IR)was measured with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)reduction assay.Results Compared with that of the control group,lower concentration of Eq(6.25 and 12.5 μmol/L)reduced intracellular ROS,whereas the higher concentration(100 μmol/L)of Eq increased intracellular ROS.The apoptosis rates of the cells treated with Eq of higher concentration(25,50 and 100 μmol/L)were increased(9.67%,12.17%,and 12.87%).Lower concentration of Ep did not affect the cell cycle also,while higher concentration of Ep caused G1 arrest.The IR of the ECV-304 cells treated with different concentrations of Eq(6.25,12.5,25,50,and 100 μmol/L) were -8.23±2.21%,-3.29±1.07%,6.75±1.73%,25.46.23±4.82%,and 36.93±4.66%,respectively.Lower concentration of Eq promoted but the higher concentration inhibited the proliferation of the cells.Compared with the control group,the expression of Bax and caspase-3 in the cells treated with Eq(25 μmol/L)for 24 hours increased,while the expression of Bcl-2 decreased.Conclusion Lower concentration of Eq could reduce intracellular ROS,promote cell proliferation,while higher concentration of Eq could induce cell apoptosis and cell cycle arrest.
Key words: vascular endothelial cell     cell apoptosis     proliferation inhibition     equol    

大豆中异黄酮类化合物的总称为大豆异黄酮(soybean isoflavones，SI)。研究表明SI具有多种生物学活性,如雌激素样作用、抗氧化、调节细胞周期等[1]。SI在肿瘤治疗、防治心血管疾病和缓解更年期症状等方面的价值倍受重视。近年发现约30%的人体内在肠道菌参与下SI转化为雌马酚，体外研究表明雌马酚可抑制多种肿瘤增殖，具有抗氧化和减轻骨质疏松等作用，其生物学活性优于SI[2]。血管内皮是衬于血管腔内层的细胞，其形态功能以及增殖和凋亡平衡与心血管疾病和肿瘤关系密切。本研究通过观察雌马酚对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及机制，旨在为疾病预防和治疗领域中雌马酚的合理应用提供依据，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

雌马酚(北京百灵威科技有限公司)；噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]和活性氧(reactive oxygen species，ROS)荧光探针双氯荧光黄乙酸乙酯(dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)(上海碧云天生物技术研究所)；1640培养液(美国Gibco公司)；小牛血清(美国Hyclone公司)；碘化丙啶(propidium iodide，PI)和annexin-V-FITC1细胞凋亡试剂盒(美国eBiocience公司)。EPICS-X流式细胞仪(美国贝克曼公司)。 1.2 细胞培养与处理

自液氮中取出冻存血管内皮细胞(ECV-304)，复苏后在含10%小牛血清1640培养液、5%CO2、饱和湿度和37 ℃条件下培养，用含0.5% 胰蛋白酶和0.2%乙二胺四乙酸的消化液消化细胞，2~3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。接种细胞于培养瓶，实验设对照组、雌马酚6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L组，继续培养细胞24 h，消化收集细胞待测。每组设3个平行孔。 1.3 指标与方法 1.3.1 细胞增殖抑制率检测

将细胞接种于96孔板，加入不同剂量雌马酚，继续培养72 h，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃ 孵育4 h，离心后弃去培养液，每孔加入200 μL二甲基亚砜溶解细胞内MTT还原产物，测定570 nm处吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率(%)。 1.3.2 细胞周期检测

取106个细胞，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次后用80%预冷的甲醇固定过夜；检测分析前离心弃甲醇溶液，用PBS洗涤2次，将细胞用含PI和Triton X-100和 RNA酶的染液重悬，避光染色30 min，立即用流式细胞仪分析。 1.3.3 细胞内ROS检测

取5×105个细胞，PBS洗涤2次，100 μL PBS重悬细胞，加入DCFH-DA储存液，至终浓度为5 μmol/L，混匀后在37 ℃避光反应30 min，PBS 洗2次后上流式细胞仪分析。 1.3.4 细胞凋亡分析

取5×105个细胞，用PBS洗涤2次，取195 μL结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL FITC-标记annexin-V，室温下避光反应30 min；用结合缓冲液洗涤细胞2次，400 μL 结合缓冲液重悬细胞，加入PI 溶液5 μL，5 min后用流式细胞仪分析。 1.3.5 细胞爬片和免疫组化

传代细胞接种于24孔板(内置无菌玻片)，实验设对照组、雌马酚25.00 μmol/L组，继续培养至细胞覆盖面积大于玻片40%(细胞数量1×104～2×104个)时，多聚甲醛固定，试剂盒法进行免疫组化染色，封片拍照。 1.4 统计分析

数据以x±s表示，采用SPSS 10.0 软件进行统计处理，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 雌马酚对ECV-304细胞增殖影响

雌马酚6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L组ECV-304细胞增殖抑制率分别为-(8.23±2.21)%、-(3.29±1.07)%、(6.75±1.73)%、(25.46±4.82)%和(36.93±4.66)%，与对照组比较，低浓度雌马酚(6.25、12.5 μmol/L)对ECV-304细胞增殖表现出较弱的促进作用，较高浓度雌马酚(＞25.00 μmol/L)对ECV-304细胞增殖具有抑制作用，呈剂量效应关系(P<0.05)。 2.2 雌马酚对ECV-304细胞周期影响(表 1)

与对照组比较，雌马酚6.25、12.50 μmol/L组ECV-304细胞周期无明显变化，雌马酚25.00、50.00、100.00 μmol/L组ECV-304细胞G1期百分比均明显增加，G2期百分率均下降(P<0.05)。

表 1 雌马酚对ECV-304细胞周期影响(%，x±s，n=3)
2.3 雌马酚对ECV-304细胞内活性氧含量影响

结果显示，对照组、雌马酚6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L组ECV-304细胞内活性氧含量(绿色荧光强度)分别为(69.8±4.3)、(62.5±5.3)、(65.4±4.9)、(67.2±4.6)、(71.3±6.4)、(80.9±6.5)；与对照组比较，100 μmol/L雌马酚组ECV-304细胞内活性氧增加(P<0.05)。 2.4 雌马酚对ECV-304细胞凋亡影响(表 2)

结果表明，低浓度雌马酚对ECV-304细胞凋亡无明显影响；与对照组比较，雌马酚25.00、50.00、100.00 μmol/L组ECV-304细胞早、晚期凋亡率均明显增加(P<0.05)。

表 2 雌马酚对ECV-304细胞凋亡影响(%，x±s，n=3)
2.5 雌马酚对ECV-304细胞凋亡相关分子表达影响(图 1)

结果显示，对照组、25 μmol/L雌马酚组ECV-304细胞内Bax、Bcl-2、caspase-3表达量分别为(1.012±0.115)、(1.682±0.172)、(0.628±0.096)和(1.451±0.164)、(1.022±0.125)、(0.974±0.084)；与对照组比较，25 μmol/L雌马酚组ECV-304细胞内Bax表达增加，Bcl-2表达下降，caspase-3表达增加。

图 1 雌马酚对凋亡相关蛋白分子表达影响(免疫组化，×400)
3 讨 论

大豆苷元和染料木黄酮是SI的主要苷元成分，大豆苷元在体内经由某些特定肠道菌代谢后最终产物为雌马酚。近年研究表明，雌马酚较其母体更易被吸收，也具有更高的生理活性[1, 2]。雌马酚主要生理活性包括雌激素样作用和抗氧化作用。雌马酚对雌激素依赖生长的肿瘤具有一定的预防和治疗作用[3]。当雌激素缺乏时可产生替代雌激素的作用，更年期妇女可用雌马酚或食用豆制品减轻潮红和骨质流失等症状[4]。自由基通过损伤DNA参与肿瘤发生，快速增殖的肿瘤也在细胞内产生自由基[5]。

血管内皮细胞是指衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮，形成血管的内壁。血管内皮细胞具有吞噬异物和衰老细胞成分，以及介导免疫细胞迁移、趋化功能。高血压、炎症、感染等情况下，内皮细胞可通过活化、释放细胞因子、促发血小板凝集等参与病理变化，其自身也可发生凋亡或通过增殖而自我修复[6]。肿瘤发生过程中，需伴随内皮细胞增殖和血管新生。本研究结果显示，雌马酚对内皮细胞的作用与其浓度关系密切，低浓度雌马酚对血管内皮增殖具有一定的促进作用，同时可降低细胞内活性氧，对细胞凋亡无明显影响；而高浓度雌马酚可导致细胞内活性氧增加，细胞凋亡率升高，细胞周期阻滞，从而表现出对血管内皮细胞增殖抑制作用。提示，在应用雌马酚预防心脑血管疾病时，需注意限制用量。

近年来发现，SI和雌马酚可诱导乳腺癌、卵巢、前列腺癌等多种肿瘤细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的机制与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶和丝裂原活化的蛋白激酶等信号途径有关[7]，Bax和Bcl-2的比值在线粒体损伤启动凋亡的时相往往增加[8]。本研究结果表明，高浓度雌马酚可诱导ECV-304细胞凋亡，细胞内caspase家族凋亡效应性分子caspase-3表达增加，雌马酚处理后，细胞内Bax表达增加而Bcl-2表达下降。提示线粒体途径(内源性细胞凋亡途径)可能参与了雌马酚诱导细胞凋亡过程。但具体机制尚有待于进一步深入研究。

参考文献
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[3] Kang HJ, Ansbacher R, Hammond MM.Use of alternative and complementary medicine in menopause[J].International J Gynecol Obstetrics, 2002, 79:195-207.
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