随着生活水平提高，肥胖发生率在全球呈现增高趋势^[1]。肥胖是众多疾病的危险因素，其中对雄性生殖影响的相关研究已经引起众多学者关注^[2]，目前主要观点是肥胖可引起雄性激素水平下降^[3]，在引起雄性激素变化的机制中，氧化应激是重要因素之一^[4]。氧化应激是指细胞暴露于高浓度氧分子或氧的化学衍生物而引起的细胞损伤。自由基作用于生物大分子，破坏细胞结构，导致一系列疾病的发生发展^[5]。过氧化氢(H₂O₂)是一种氧化作用较强的活性氧，是机体自由基产生的重要环节，易于获得，性质相对稳定，已成为细胞氧化损伤模型制备的重要工具^[6]。本研究利用小鼠睾丸间质细胞(TM3)，以H₂O₂为诱导剂构建体外氧化应激细胞模型，旨在为肥胖对生殖影响的机制研究以及筛选抗氧化剂实验提供参考。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

TM3细胞(中科院细胞库)，胰蛋白酶(中国BIOSHARP公司)，达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modifled eagles medium，DMEM)(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，H₂O₂(辽宁新兴试剂有限公司)，二甲基亚砜(天津大茂化学试剂厂)，活性氧、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAOC)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；睾酮酶联免疫测定试剂盒(美国Enzo Life Sciences公司)。CO₂培养箱(沈阳市伟明医疗设备厂)、37XB倒置显微镜(上海光学仪器五厂)、UV-2000紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)、MK₃酶标仪(上海赛默飞世尔仪器有限公司)。 1.2 方法 1.2.1 TM3细胞培养与分组处理

将TM3细胞按5×10⁵个/mL接种在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10 mmol/L Hepes缓冲液、2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培养基中，37 ℃、5%CO₂温育，每2～3 d 传代1 次，取对数生长期细胞用于实验。实验设对照组、H₂O₂ 150、300、600 μmol/L组，每组做4孔平行样，试验重复3次。 1.2.2 细胞存活率检测

采用噻唑蓝法，取对数生长期TM3细胞以3.5×10⁴个/mL密度接种于96孔板上，于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养 24 h 后，去除培养液，每孔加入不同浓度H₂O₂ 100 μL作用4 h，加入20 μL 5 g/L噻唑蓝，温育4 h，去除培养液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，用酶标仪测定各孔492 nm处吸光度(A)值。 1.2.3 上清液中睾酮水平检测

采用酶联免疫吸附试验，取细胞培养液，加入类固醇取代试剂及抗体，室温下摇床孵育1 h，每孔内加入50 μL blue conjugate，继续室温孵育1 h，清空96孔板，洗3次，充分吸干板内液体，加入200 μL pNpp substrate solution，37 ℃孵育1 h，在405 nm处检测各孔吸光度(A)值。 1.2.4 活性氧、SOD、TAOC、CAT活性测定

取细胞，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，4 000 r/min离心5 min 收集细胞，超声破碎细胞并释放其中抗氧化物，4 ℃ 12 000 g离心5 min，取上清液，参照试剂盒说明书测定细胞内活性氧含量、TAOC、SOD、CAT活性；蛋白质定量采用二喹啉甲酸蛋白试剂盒测定。 1.3 统计分析

数据采用x±s表示，采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析，多组之间比较采用方差分析，两两比较采用最小显著差法，检验水准为α=0.05。 2 结 果 2.1 H₂O₂对TM3细胞存活率及睾酮水平影响(表 1)

与对照组比较，300、600 μmol/L H₂O₂ 组TM3细胞存活率均降低(P<0.05)，各H₂O₂ 组TM3细胞睾酮水平均明显降低(P<0.05)，呈剂量效应关系。

表 1

表 1 H2O2对TM3细胞活力及睾酮水平影响(x±s，n=4) 组别(μmol/L) 细胞存活率(%) 睾酮(pg/mL) 对照组 100.0±1.7 250.09±26.70 H2O2组 150 92.5±2.8 188.93±7.06a 300 86.7±4.3a 179.23±6.66a 600 46.3±2.0b 131.59±11.26b 注：与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01

表 1 H2O2对TM3细胞活力及睾酮水平影响(x±s，n=4)

与对照组比较，600 μmol/L 组TM3细胞TAOC活性明显降低(P<0.05)，各剂量H₂O₂组TM3细胞SOD、CAT活性均明显降低(P<0.05)；与对照组比较，各剂量H₂O₂组TM3细胞活性氧含量无明显变化。

表 2

表 2 H2O2对TM3细胞活性氧含量、TAOC、SOD、CAT活性影响(x±s，n=4) 组别 (μmol/L) ROS TAOC (mmol/g) SOD (U/mg protein) CAT (U/mg protein) 对照组 2.72±0.01 0.53±0.27 6.32±0.72 167.54±3.11 H2O2组 150 2.89±0.07 0.49±0.13 2.42±0.17b 56.76±12.17a 300 2.59±0.03 0.49±0.16 2.69±0.30b 23.45±2.17b 600 2.93±0.02 0.36±0.18a 0.44±0.41b 24.55±18.05b 注：与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 2 H2O2对TM3细胞活性氧含量、TAOC、SOD、CAT活性影响(x±s，n=4)

近年来肥胖与雄性不育的关系已引起广泛关注。肥胖引起生殖功能下降的原因主要是雄性激素水平的下降^[7]，雄激素主要由睾丸间质细胞分泌，睾丸间质细胞的主要功能在于维持生精作用、刺激生殖器官的生长发育和维持正常的性欲等。研究表明肥胖会引起睾丸间质细胞损伤从而引起雄性激素分泌减少，而氧化应激被认为可能在间质细胞损伤中起到重要作用^[8]，本研究结果显示，随着H₂O₂浓度增加，TM3细胞分泌睾酮的功能逐渐下降，表明H₂O₂对间质细胞的损伤作用既可引起细胞数量下降，也会引起细胞功能损伤。氧自由基导致的脂质过氧化反应是引起多脏器损伤的主要原因，体内的活性氧和抗氧化系统通常处于动态平衡状态，当平衡被打破时，对机体产生损伤作用^[9]。本研究结果表明，与对照组比较，各剂量H₂O₂组TM3细胞内ROS含量无明显变化，而随着H₂O₂浓度升高，TAOC、SOD和CAT活性均明显降低。TAOC包括酶系和非酶系抗氧化系统^[10]，TAOC下降提示TM3细胞分泌睾酮功能损伤是由于抗氧化能力受到损伤从而使平衡被打破所引起的，H₂O₂氧化损伤作用机制可能主要是由SOD和过氧化氢酶的降低所致。