中国公共卫生  2015, Vol. 31 Issue (2): 199-201   PDF    
引用本文
薛淑莲, 魏俊妮, 汪波, 双杰钰, 冯丽萍 . 胎盘凋亡及细胞转运与新生儿PBMC HBsAg关系[J]. 中国公共卫生, 2015, 31(2): 199-201.
XUE Shu-lian, WEI Jun-ni, WANG Bo, et al. Association of placental apoptosis and PBMC transfer with HBsAg of PBMC in neonates[J]. Chinese Journal of Public Health, 2015, 31(2): 199-201.
胎盘凋亡及细胞转运与新生儿PBMC HBsAg关系
薛淑莲1, 魏俊妮1 , 汪波2, 双杰钰2, 冯丽萍2    
1. 山西医科大学公共卫生学院流行病学教研室, 山西 太原 030001;
2. 太原市第三人民医院妇产科
数字出版日期：2015-1-13 10:01.
基金项目：国家自然科学基金(30901227);山西省基础研究项目(青年科技研究基金,2011021038-3);山西医科大学博士启动基金(B03201208)
作者简介：薛淑莲(1958-),女,山西太原人,高级实验师,大专,研究方向:流行病学。
通讯联系人：魏俊妮,E-mail:junxinni@163.com
摘要：目的 探讨胎盘凋亡及外周血单个核细胞(PBMC)母-胎转运与HBsAg阳性孕妇新生儿PBMC HBsAg的关系。方法 用等位基因特异性PCR(As-PCR)筛选母儿信息病例对,用原位末端杂交法检测HBsAg阳性孕妇足月胎盘凋亡指数,用免疫荧光双标法检测新生儿PBMC涂片上的HBsAg和谷胱甘肽S转移酶(GST);采用SPSS 16.0软件进行分析。结果 86例新生儿PBMC中20例(23.26%)HBsAg阳性,31例(36.05%)GST阳性,HBsAg、GST共存者13例(15.12%);发生PBMC母-胎转运组的胎盘凋亡指数与未发生转运组的胎盘凋亡指数差异有统计学意义(t'=2.38,P=0.02),且胎盘滋养层细胞凋亡率高与PBMC转运相关(t=2.75,P=0.01);新生儿PBMC HBsAg阳性组的胎盘细胞凋亡指数与阴性组的胎盘细胞凋亡指数差异无统计学意义(t=0.34,P=0.74);PBMC转运与新生儿PBMC HBsAg阳性有关(χ2=9.48,P=0.00),发生PBMC转运的新生儿发生PBMC HBsAg阳性的危险性是未发生PBMC转运新生儿的4.95倍(OR=4.95,95%CI=1.70~14.39)。结论 妊晚期胎盘细胞凋亡增加有利于PBMC母-胎转运,感染HBV的PBMC可能通过胎盘进入胎儿血循环进而导致新生儿HBV感染。
关键词： 细胞凋亡     乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)     胎盘     免疫荧光    
Association of placental apoptosis and PBMC transfer with HBsAg of PBMC in neonates
XUE Shu-lian1, WEI Jun-ni1 , WANG Bo2, et al    
Department of Epidemiology, School of Public Health, Shanxi Medical University, Taiyuan, Shanxi Province 030001, China
Abstract: Objective To explore the relationship between placental apoptosis,peripheral blood mononuclear cell(PBMC)transfer from mother to baby and hepatits B virus surface antigen(HBsAg)of PBMC in the neonates born to HBsAg positive pregnant women.Methods Mother-baby pairs were screened with allele-specific PCR(As-PCR).Teminal deoxy nucleotidyl transferase(TdT-)mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) method was used to detect placenta apoptosis index of HBsAg-positive full term pregnant women.Immunofluorescence double labeling method was used to detect HBsAg and glutathione S transferase(GST) in neonatal PBMC smear samples.Statistical analysis was performed by using SPSS 16.0.Results Of 86 neonatal PBMC smear samples,20(23.30%)were HBsAg positive,31(36.00%)were GST positive,and 13(15.12%)were both HBsAg positive and GST positive(15.12%),respectively.The placental cell apoptosis index was significantly different between the pregnant women with and without PBMC transfer(t'=2.38,P=0.02),and the rate of apoptosis in placetal trophoblast cells and PBMC transfer was related( t=2.75,P=0.01).Placental apoptosis index between PBMC HBsAg positive and negative neonates was not significantly different(t=0.34,P=0.74).There was a correlation between PBMC transfer from mother to baby and HBsAg positive of PBMC in neonates(χ2=9.48,P=0.00),and the risk of HBsAg positive of PBMC in the neonates with PBMC transfer was 4.95(95%confidence interval:1.70-14.39)times higher than in the neonates without PBMC transfter.Conclusion Placental apoptosis may increase placental permeability during late pregnancy,which is beneficial to the mother-baby transfer of PBMC.PBMC infected with HBV may pass into fetal blood circulation through placenta and induce HBV infection in neonates.
Key words: apoptosis     hepatitis B virus surface antigen(HBsAg)     placenta     immunofluorescence    

有研究表明，妊娠过程中母胎除了进行正常的物质交换外，还可发生细胞的转运[1]。外周血单核细胞(peripheral blood monouclear cells,PBMC)是HBV肝外贮存、复制和繁殖的场所[2, 3]。为了解新生儿HBV感染的具体机制，本研究选取2005年1月—2009年2月山西省太原市传染病医院(太原市第三人民医院)的HBsAg阳性孕妇及其新生儿为研究对象，探讨胎盘细胞凋亡、PBMC母-胎转运与新生儿PBMC HBsAg的关系。现将结果报告如下。 1 对象与方法 1.1 对象

以2005年1月—2009年2月在太原市传染病医院(太原市第三人民医院)妇产科进行产前检查并分娩的HBsAg阳性孕妇及其新生儿86对作为研究对象。HBsAg阳性孕妇外周血、胎盘组织和其新生儿外周血的获取均经母亲同意并签署知情同意书。 1.2 材料

无菌条件下采集孕妇分娩时足月胎盘，大小为1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，立即置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋,做4～5 μm切片备用。同时采集孕妇肘静脉抗凝血和新生儿股静脉抗凝血，分离PBMC，孕妇PBMC于-20 ℃保存备检；新生儿PBMC涂片，4 ℃保存备检。 1.3 实验室检测方法

(1)HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC中谷胱甘肽-S-转移酶M1基因(glutathione S transferase M1 gene，GSTM1)基因检测：参照文献[4]。(2)采用原位末端杂交法检测胎盘细胞凋亡指数。Tunel检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展公司，严格按照操作说明书进行。(3)采用免疫荧光双标法检测新生儿PBMC涂片上HBsAg、GST。操作步骤如下：PBMC涂片置磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)中浸洗30 min；0.3%的TritonX-100湿盒室温30 min，PBS振洗3 min×3次；正常兔血清封闭液和5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)湿盒37 ℃封闭40 min 后甩去封闭液；加入鼠抗人HBsAg抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)(1:2000)，兔抗人GST抗体(北京康为世纪生物科技有限公司)(1：200)湿盒4 ℃过夜，PBS振洗3 min×3次；四乙基若丹明异硫氰酸盐(tetraethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC)标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京康为世纪生物科技有限公司)(1∶50),37 ℃孵育1 h；加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京康为世纪生物科技有限公司)(1∶50),37 ℃孵育1 h，PBS 漂洗3次；缓冲甘油封固，利用激光扫描共聚焦显微镜观察免疫荧光染色结果并采集图片，对于同一标本同一部位用2种激发滤片分别照相。同时设立：①阳性对照：免疫组化法检测HBsAg阳性的胎盘组织；②阴性对照：血清学HBV感染标志全阴性的PBMC涂片(正常人PBMC涂片)；③空白对照：不加鼠抗人HBsAg，兔抗人GST，代之以PBS；④替代对照：不加鼠抗人HBsAg，兔抗人GST，代之以正常血清。 1.4 统计分析

应用SPSS 16.0软件建立数据库并进行分析，2组资料的比较采用t检验及χ2检验。 2 结 果 2.1 一般情况

共收集母亲GSTM1+基因型且其新生儿GSTM1-基因型的信息病例对86对。HBsAg阳性孕妇均为汉族，年龄平均(27.91±4.36)岁，其中HBsAg、HBeAg双阳性者占34.90%(30/86)。HBsAg阳性孕妇中78例为孕前HBsAg阳性并持续携带至今，余8例为孕后产前检查首次发现HBsAg阳性。HBsAg阳性孕妇所生新生儿自然产占53.50%(46/86),剖宫产占46.50%(40/86)；新生儿体重为(3340.50±42.55)g。 2.2 PBMC中HBsAg及GST分布情况 2.2.1 镜下观察结果

免疫荧光双标记技术检测HBsAg 及GST，荧光素TRITC激发出红色荧光作为阳性信号，PBMC中显示红色荧光者为阳性，即有HBsAg表达。荧光素FITC激发出绿色荧光作为阳性信号，PBMC中显示绿色荧光者为阳性，即有GST表达。应用TRITC和FITC对PBMC进行双标记检测时，若2种待测物分布于细胞的同一部位，则可产生红、绿2种颜色的重叠色黄色荧光。激光共聚焦显微镜下显示，阴性对照、空白对照、替代对照的PBMC涂片中均无红色荧光、绿色荧光信号；HBsAg阳性PBMC涂片中显示有红色荧光，荧光信号显示在胞膜和胞浆部位；GST表达阳性的PBMC涂片中GST分布在胞浆部位，HBsAg、GST共定位的部位有黄色荧光。 2.2.2 分布情况

86例新生儿PBMC中检出20例HBsAg阳性者，阳性率为23.26%；检出31例GST阳性者，阳性率为36.05%；HBsAg、GST共存者13例，阳性率为15.12%；发生PBMC转运者中有41.94%(13/31)发生了感染HBV的PBMC转运。 2.3 胎盘细胞凋亡与PBMC转运关系(表 1)

发生PBMC母-胎转运组的胎盘细胞凋亡指数高于未发生转运组的胎盘细胞凋亡指数，差异有统计学意义(t′=2.38，P=0.02)；且胎盘滋养层细胞的凋亡率高与PBMC转运相关(t=2.75，P=0.01)。

表 1 胎盘细胞凋亡与PBMC转运关系(n=86)
2.4 胎盘细胞凋亡与新生儿PBMC HBsAg阳性关系

新生儿 PBMC HBsAg阳性组的胎盘细胞凋亡指数为(4.62±0.15)%，低于阴性组的(4.68±0.09)%，但差异无统计学意义(t=0.34，P=0.74)。 2.5 PBMC转运与新生儿PBMC HBsAg阳性关系(表 2)

PBMC转运与新生儿PBMC HBsAg阳性有关(χ2=9.48，P=0.00)，发生PBMC转运的新生儿发生PBMC HBsAg阳性的危险性是未发生PBMC转运新生儿的4.95倍(95%CI=1.70～14.39)。

表 2 PBMC转运与新生儿PBMC HBsAg阳性关系
3 讨 论

研究显示，母亲PBMC HBV感染与新生儿PBMC HBV感染有关，可能是新生儿宫内感染的另一条途径[5]，但尚缺乏相应的证据。Smith等[6]研究表明，晚期妊娠胎盘组织凋亡发生率明显高于早期妊娠时的胎盘组织。一方面胎盘屏障通透性的增加促进了母儿间的物质交换，满足了日益长大的胎儿对物质的需求；另一方面有证据指出，通过这种不完全的屏障存在着细胞转运[1, 7]。PBMC作为HBV肝外复制、贮存的场所，在HBV的感染中有不可忽视的作用。如果乙肝母亲的PBMC感染了HBV，则可能在妊晚期胎盘通透性增加的情况下通过胎盘而感染胎儿。因此，研究胎盘凋亡与母胎PBMC转运及其在新生儿PBMC HBV感染中的作用，将有助于深入揭示HBV宫内感染的发病机制，并为有效防治措施的制定提供新思路。本研究结果显示，在新生儿的外周血中检测到母亲的细胞，证实了孕期母亲的细胞可以通过胎盘进入胎儿血循环。而且发生PBMC母-胎转运组的胎盘细胞凋亡指数高于未发生转运组，即胎盘细胞凋亡率高与PBMC转运有关。

国内学者采用双重原位杂交技术检测54例GSTM1基因缺失型的新生儿(其母该基因为表达型) PBMC涂片中GSTM1和HBV DNA[8]，该研究从基因水平提示感染HBV的母亲PBMC可通过胎盘屏障进入胎儿血循环进而感染胎儿。而发生转运的PBMC中母亲基因如何表达及转运的PBMC中HBV基因的表达和母亲基因表达的关系相关报道较少。为此，本研究采用免疫荧光双标记术并结合激光共聚焦显微镜检测86例GST缺失型的新生儿(其母为GST表达型)PBMC涂片上的HBsAg 及GST分布情况，结果表明，23.30%(20/86)的新生儿PBMC HBsAg阳性；36.00%(31/86)GST阳性，即36.00%的母儿发生了PBMC母-胎转运，低于有关报道的62.96%[8]及Shao等[9]报道的53.33%；HBsAg、GST共存者13例，阳性率为15.12%，即15.12%的母儿发生了感染HBV的PBMC转运，略低于有关报道的27.78%[8]；发生PBMC转运者中,有41.94%发生了感染HBV的PBMC转运。进一步分析表明，PBMC转运与新生儿PBMC HBsAg阳性有关(χ2=9.48，P=0.00)，发生PBMC转运的新生儿发生PBMC HBsAg阳性的危险性是未发生PBMC转运新生儿的4.95倍。提示发生转运的PBMC中,可以同时表达母亲的基因和病毒的基因，PBMC母-胎转运可能是HBV宫内感染的另一条重要感染途径。本研究结果表明，妊晚期胎盘细胞凋亡增加了胎盘屏障的通透性，使PBMC介导HBV通过胎盘屏障转运至胎儿体内进而导致胎儿感染。但本研究未发现胎盘细胞凋亡与新生儿PBMC HBsAg有关，提示可能存在其他影响因素，有待进一步研究。

参考文献
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