灵芝为多孔菌科的真菌，含有丰富的多糖、氨基酸和有机锗，具有护肝、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等多种药理活性。锗是一种微量元素，研究表明有机锗具有抗脂质过氧化、抗肿瘤、刺激造血系统等生理功能^[1]，已被广泛用于医疗保健，富锗灵芝营养成分较普通灵芝更高，尤其含有丰富的有机锗、铁、锌和氨基酸。研究证实，富锗灵芝可加速肝损伤小鼠自由基清除，减少脂质过氧化的发生，稳定细胞膜结构，减轻自由基对小鼠肝组织细胞的损害作用^[2]。本研究采用四氯化碳(CCl₄)制备大鼠肝损伤模型，探讨富锗灵芝对CCl₄所致大鼠肝损伤的保护作用，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

富锗灵芝胶囊(大连三禾生物有限公司)主要功效成分为有机锗、灵芝，血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，分析纯四氯化碳(沈阳市医药公司)；电子天平(德国赛多利斯公司)，全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)，切片机、自动脱水机、自动染片机、包埋机(美国Thermo公司)；动物组织病理影像分析系统(德国徕卡公司)。 1.2 实验动物分组与处理

180~220 g清洁级Wistar雄性大鼠50只(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002。大鼠饲养在屏障系统环境中，温度(22±2) ℃，湿度为40%~70%，普通颗粒饲料，自由饮食饮水，单笼饲养。大鼠适应性饲养1周后，随机分为5组，分别为对照组、模型组及富锗灵芝高、中、低剂量组，每组10只，对照组与模型组大鼠灌胃蒸馏水，高、中、低剂量富锗灵芝组分别灌胃给予450、230、80 mg/kg富锗灵芝水溶液，连续30 d；末次灌胃前1 d，各组大鼠禁食16 h，模型组与富锗灵芝组一次性灌胃给予0.2%CCl₄，灌胃容量为5.0 mL/kg，制备肝损伤模型，对照组给予等容积大豆色拉油；给予CCl₄ 24 h，称重后由大鼠内眦静脉丛取血，离心分离血清待测，处死后取肝脏做组织病理学检查。 1.3 指标与方法 1.3.1 体重观察

于试验末分别称量大鼠体重、计算体重增重。 1.3.2 大鼠肝功能指标观察

大鼠血清中ALT、AST按照试剂盒说明书进行。 1.3.3 肝脏病理组织学检测

于大鼠肝左叶中部做横断面取材，肝组织用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)，用40倍光镜连续观察40个视野。采用动物组织病理影像分析系统对肝组织病理改变评分。 1.4 统计分析

数据均以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 富锗灵芝对肝损伤大鼠体重影响

对照组、模型组、富锗灵芝450、230、80 mg/kg组大鼠体重分别为(318.10±15.24)、(321.80±15.63)、(310.40±13.18)、(330.00±12.95)、(330.20±13.46)g；大鼠体重增重分别为(123.90±13.34)、(127.70±17.54)、(115.00±11.19)、(136.10±13.90)、(137.40±15.58) g。与对照组比较，模型组、各剂量富锗灵芝组大鼠体重、体重增重无明显变化。提示CCl4造模过程、不同剂量富锗灵芝的摄入对大鼠生长发育均无明显影响。 2.2 富锗灵芝对肝损伤大鼠血清酶活性影响(表 1)

结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST活性明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)，提示肝损伤模型制备成功；与模型组比较，富锗灵芝230、80 mg/kg组大鼠血清ALT、AST活性明显降低(P<0.05)。

表 1

表 1 富锗灵芝对肝损伤大鼠血清酶活性影响(IU/L，x±s，n=10) 组别(mg/kg) AST ALT 对照组 205.60±118.01 55.10±20.90 模型组 423.60±139.85a 258.00±64.81a 富锗灵芝450 399.80±115.06 247.00±72.72 富锗灵芝230 264.00±187.02b 131.30±98.94c 富锗灵芝80 265.70±140.59b 138.50±86.08c

表 1 富锗灵芝对肝损伤大鼠血清酶活性影响(IU/L，x±s，n=10)

对照组大鼠肝组织结构正常，肝细胞排列整齐，胞核染色质分布均匀，未见变性、坏死(图 1A)；模型组大鼠肝细胞排列紊乱，肝窦明显变窄，多数肝细胞表现为水样变性，部分肝细胞呈气球样变，可见明显的点状坏死和小灶状坏死(图 1B)；与模型组比较，450 mg/kg富锗灵芝组大鼠肝脏组织病理学改善不明显(图 1C)；230、80 mg/kg富锗灵芝组大鼠可见部分肝细胞水样变性，但以轻度为主，坏死不明显，病变轻于模型组(图 1D、E)。肝组织病理评分结果表明，模型组大鼠各项肝损伤评分均明显高于对照组(P<0.01)，进一步提示CCl₄肝损伤造模成功；与模型组比较，230、80 mg/kg富锗灵芝组大鼠肝细胞坏死评分与病变总评分均明显降低(P<0.01)(表 2)。

图 1

注：A：对照组；B：模型组；C、D、E：富锗灵芝高、中、低剂量组。 图 1 富锗灵芝对肝损伤大鼠肝脏组织病理学影响(HE，40×)

表 2

表 2 各组大鼠肝脏病理组织评分比较(分，x±s，n=10) 组别(mg/kg) 气球变性 水样变性 脂肪变性 胞浆凝集 肝细胞坏死 总评分 对照组 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 模型组 3.50±4.20a 96.90±29.90a 9.70±10.87a 15.00±8.23a 34.70±3.56a 194.50±27.71a 富锗灵芝    450 4.10±3.63 94.10±28.36 11.40±9.19 14.80±7.60 32.90±4.41 190.20±36.49                     230 6.70±7.60 73.50±32.88 6.00±7.79 11.40±9.80 21.90±10.33b 141.40±48.35b                       80 5.90±11.61 54.40±27.19b 12.80±11.25 14.60±11.49 23.20±12.80b 134.10±25.89b 注：与对照组比较，a P<0.01；与模型组比较，b P<0.01。

表 2 各组大鼠肝脏病理组织评分比较(分，x±s，n=10)

CCl₄是目前常用复制动物急性肝损伤模型的经典物质(化学性损伤)。采用CCl₄制备肝损伤模型可准确反应肝细胞功能、代谢及形态学变化，重复性好，肝细胞受损最基本表现是细胞质膜的损伤^{[3, 4]}。自由基和脂质过氧化在肝损伤中起着十分重要作用，自由基的形成及引发的链式过氧化反应是CCl₄性肝损伤的主要机制^{[5, 6]}。CCl₄进入体内后，经肝脏细胞色素P450激活，生成活性自由基(CCl₃O₂·和CCl₃·)及一系列氧活性物质，并诱导膜系统发生脂质过氧化反应，膜磷脂大量降解，从而破坏生物膜结构的完整性，导致糖原、蛋白质合成障碍，从而使ALT、AST释放入血，造成血清ALT与AST的酶活性显著升高^[7]，膜通透性增高最终导致肝细胞死亡^[8]。CCl₃·还可抑制细胞膜和微粒体膜上钙泵活性，使钙离子内流增加，造成肝细胞脂质过氧化性损伤，从而导致肝细胞变性、坏死、脂肪变性、纤维化和癌变^[9]。

本研究结果显示，模型组大鼠血清中ALT、AST活性明显高于对照组，肝组织病理学检查进一步证实CCl₄已导致肝细胞明显损伤，表明复制CCl₄急性肝损伤模型成功。本研究结果还显示，与模型组比较，中、低剂量富锗灵芝组大鼠血清中ALT和AST水平明显降低，低剂量富锗灵芝组大鼠肝细胞水样变性、肝细胞坏死病变明显减轻，中、低剂量富锗灵芝组大鼠肝细胞坏死评分及病变总评分明显下降。提示富锗灵芝胶囊在一定范围内(80~230 mg/kg)，对CCl₄所致肝损伤具有一定保护作用。本研究结果表明，与模型组比较，高剂量富锗灵芝组(450 mg/kg)大鼠各项指标变化并不明显，可能与实验动物个体差异有关，值得扩大样本量进一步深入探讨。