流行病学调查研究发现，多食用蔬菜和水果可降低人类慢性疾病的危险性^{[1, 2]}。蔬菜，水果和谷物中富含有多种植物多酚类化合物，其中类异戊二烯是其主要的组成成分，它是植物代谢的中间产物，表现出较强的抗氧化生物活性。在诸多类异戊二烯成份中，β-紫罗兰酮是其一个单体。近年来研究表明，β-紫罗兰酮对肿瘤细胞有明显的抑制作用^{[3, 4, 5]}，对肿瘤细胞转移也有影响，但其作用机理尚不清楚，而在细胞培养研究中，仅见有少量的报道^{[3, 5]}。本研究采用体外细胞培养方法，研究β-紫罗兰酮作用于人乳腺癌细胞(Michigan Cancer Foundation-7，MCF-7)不同时间后，对细胞凋亡作用的影响，为探明β-紫罗兰酮的抑癌机制提供参考依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 受试物

β-紫罗兰酮(GC纯度>95%，美国Sigma公司)可溶于乙醇中，根据细胞毒性试验，确定β-紫罗兰酮的剂量为25、50、100和200 μmol/L。 1.1.2 人乳腺癌细胞(MCF-7)培养

MCF-7细胞(北京市肿瘤研究所)在含青链霉素和10%新生牛血清RPMI1640(Gibco,NY,USA)培养液(含谷氨酰胺)中，于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养，用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)/胰酶混合液消化、传代。 1.2 方法 1.2.1 细胞生长曲线^[6]

采用噻唑蓝(thiazole blue，MTT)方法绘制β-紫罗兰酮作用MCF-7细胞的生长曲线。每个剂量设6个平行样。培养1～7 d后，绘制细胞生长曲线，并计算细胞增殖抑制率及IC₅₀。 1.2.2 MCF-7细胞凋亡荧光显微镜观察^[7]

常规培养MCF-7细胞。分别用不同浓度β-紫罗兰酮处理24 h和48 h后，用Hoechst 33342荧光染料染色，每个剂量组有3个平行样，在荧光倒置显微镜下，观察MCF-7细胞核形态，该实验重复一次。 1.2.3 MCF-7细胞凋亡电镜观察^[7]

MCF-7细胞分别用不同浓度β-紫罗兰酮处理24 h和48 h后。常规制片，电子显微镜下观察。每个剂量组有3个平行样。 1.2.4 TUNEL方法检测MCF-7细胞凋亡^[8]

用不同浓度的β-紫罗兰酮处理MCF-7细胞24 h和48 h后，凋亡的MCF-7细胞用原位杂交细胞凋亡试剂盒检测(Roche Co.Ltd,Germany)，并按照试剂盒说明书步骤处理，染色和制片。每个剂量组有3个平行样。用光镜观察结果，每组观察5个随机视野，并计算凋亡指数(AI):AI=(凋亡细胞数/观察细胞总数)×100%。 1.2.5 流式细胞光度术检测MCF-7细胞凋亡^{[7, 8]}

分别用β-紫罗兰酮处理MCF-7细胞24 h和48 h后，用碘化丙啶(PI)综合染液(PI 2.5 mg,核糖核酸酶[RNAse]10 mg，Triton X-100 0.25 mL，生理盐水32.4 mL，柠檬酸50 mg，加蒸馏水至50 mL)染色后,上机检测。对样品进行单参数DNA含量分析(2.0×10⁴个/样品)。采用Mod Fix LT软件进行细胞DNA含量分析。每剂量组有3个平行样，该实验重复1次。分析指标凋亡峰：在DNA直方图上,G₀/₁峰前出现一个低DNA含量呈左右对称的细胞峰,即为凋亡峰。 1.2.6 Western blot 检测细胞增殖(PCNA)和凋亡相关蛋白bcl-2蛋白表达情况

分别用不同浓度β-紫罗兰酮处理MCF-7细胞24 h 和48 h后，提取上清测定总蛋白含量，按等量蛋白加到10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上，电泳，杂交和检测蛋白条带。同时用β-actin做内标，结果用凝胶扫描数字成像系统进行分析。每个剂量组有3个平行样。 1.3 统计分析

采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。结果用(x±s)表示，数据比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。 2.1 生长曲线(表 1) 2 结 果

采用噻唑蓝法试验结果显示，随着时间的增加，β-紫罗兰酮明显地抑制MCF-7细胞的生长，呈现明显的剂量-反应关系。β-紫罗兰酮作用于MCF-7细胞7 d抑制率分别为6.57%、34.58%、65.22%和81.87%，β-紫罗兰酮作用于MCF-7细胞的IC₅₀值为104 mmol/L。

表 1

表 1 不同浓度β-紫罗兰酮作用于MCF-7细胞的生长曲线(n=6，mmol/L) 分组 时间(d) 1 2 3 4 5 6 7 0 0.058 1±0.012 0.068 3±0.020 0.081 6±0.036 0.225 4±0.025 0.319 3±0.023 0.497 4±0.037 0.693 5±0.035 25 0.042 9±0.015 0.047 0±0.019 0.094 3±0.021 0.209 6±0.018 0.293 3±0.020 0.462 9±0.030 0.665 9±0.030 50 0.031 9±0.001 0.052 0±0.032 0.076 2±0.010 0.160 5±0.028a 0.256 1±0.028 0.331 0±0.056b 0.363 8±0.088b 100 0.027 9±0.001 0.027 8±0.024 0.053 7±0.010 0.093 6±0.028b 0.113 5±0.012b 0.246 9±0.049b 0.112 5±0.059b 200 0.033 5±0.012 0.038 2±0.010 0.038 2±0.017 0.056 9±0.041b 0.059 1±0.014b 0.064 5±0.074b 0.074 9±0.027b 注：与阴性对照组比较，a P<0.05,b P<0.01。

表 1 不同浓度β-紫罗兰酮作用于MCF-7细胞的生长曲线(n=6，mmol/L)

用β-紫罗兰酮处理MCF-7细胞24 h和48 h后，显示出明显不同于对照组的细胞形态，如细胞缩小，染色质聚集和核固缩等细胞凋亡的形态学改变。电镜结果显示出不同于对照组的细胞形态如细胞体积缩小，细胞核内染色质浓缩在核膜下，呈大的片断，细胞膜表面突起显著地减少等凋亡细胞的改变，以β-紫罗兰酮处理后的MCF-7细胞24 h后，100 mmol/L及48 h 50 mmol/L 以上组最为显著。 2.3 细胞凋亡的检测(表 2)

用不同浓度β-紫罗兰酮作用于MCF-7细胞24 h和48 h后，MCF-7细胞的凋亡指数(AI)随着β-紫罗兰酮剂量的增加而呈现增加的趋势。β-紫罗兰酮作用MCF-7细胞后AI指数，24 h为2.17%～20.74%,48 h为3.83%～33.15%。流式细胞仪的检测结果也显示，MCF-7细胞凋亡率随着β-紫罗兰酮浓度的增加而增加，呈现剂量-反应关系；β-紫罗兰酮作用MCF-7细胞24 h和48 h后，MCF-7细胞凋亡率分别为10.04%～27.96%和9.65%～38.59%。

表 2

表 2 β-紫罗兰酮处理MCF-7细胞24 h和48 h的细胞的凋亡指数(AI)(n=6) β-ionone(μmol/L) AI(%)(TUNEL) AI(%)(flow cytometry) 24 h 48 h 24 h 48 h 0 0.52±0.13 0.61±0.29 1.03±1.26 3.89±2.53 25 2.17±0.70 3.83±1.07 10.04±0.69 9.65±1.86 50 2.93±0.48 8.37±1.33a 11.67±5.14 16.60±4.45a 100 9.18±2.57b 24.28±4.50b 19.79±6.12a 24.93±1.82b 200 20.74±3.89b 33.15±5.17b 27.96±8.42b 38.59±9.50b 注：与阴性对照组相比，a P<0.05,b P<0.01。

表 2 β-紫罗兰酮处理MCF-7细胞24 h和48 h的细胞的凋亡指数(AI)(n=6)

PCNA的表达，随着β-紫罗兰酮剂量的增加有逐渐降低的趋势，呈现剂量-反应关系，以β-紫罗兰酮作用24 h，最为明显；而bcl-2蛋白的表达也随着β-紫罗兰酮剂量的增加，作用时间的延长，呈现明显地降低趋势。

图 1

注：A和C为β-紫罗兰酮作用MCF-7细胞24 h的结果，B和D为β-紫罗兰酮作用MCF-7细胞48 h的结果。 图 1 PCNA和Bcl-2在MCF-7细胞中表达

表 3

表 3 不明原因CNS症状相关联因素单因素分析 因素 24 h 48 h Bcl-2/β-actin 25 0.66±0.04 0.73±0.10 50 0.64±0.05 0.76±0.10 100 0.58±0.03 0.56±0.12 200 0.30±0.03 0.39±0.06 PCNA/β-actin 25 1.02±0.11 0.97±0.02 50 0.99±0.12 0.83±0.09 100 0.74±0.02 0.89±0.02 200 0.56±0.01 0.77±0.07

表 3 不明原因CNS症状相关联因素单因素分析

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是一种细胞自杀性死亡，在保持机体内环境的稳定中起到重要作用。同时，细胞凋亡是通过凋亡相关因子如bcl-2，Fas和p53调节的复杂过程^{[9, 10, 11, 12, 13, 14]}。本研究表明，β-紫罗兰酮在25～200 μmol/L范围内，对MCF-7细胞有明显的抑制作用，且随着剂量增高，抑制作用增强，其IC₅₀为104 mmol/L。采用凋亡形态学观察(荧光显微镜和电镜)，可见到细胞凋亡的形态学特征；用TUNEL方法，也检测到DNA有片段化，提示MCF-7细胞有凋亡产生；用流式细胞光度术检测了用β-紫罗兰酮作用MCF-7细胞24 h和48 h后，MCF-7细胞凋亡出现的比例，发现β-紫罗兰酮可明显地诱导MCF-7细胞产生凋亡，其细胞凋亡率呈现剂量-反应关系，采用Western blotting方法检测用β-紫罗兰酮作用MCF-7细胞不同时间后，可见β-紫罗兰酮可明显地抑制PCNA蛋白和bcl-2蛋白的表达，呈现明显地剂量-反应关系，进一步可证实β-紫罗兰酮可明显地抑制MCF-7细胞的增殖，提示可能与细胞周期有关；另一方面，对bcl-2蛋白表达的抑制作用，提示β-紫罗兰酮可对bcl-2介导的凋亡途径有关^{[12, 13, 14]}。然而，β-紫罗兰酮是如何影响细胞周期和相关的凋亡途径，对雌激素表达阴性的肿瘤细胞是否有抑制作用，其具体的机制如何，需要进一步探讨。