骨质疏松症是以骨量减少为主要特征的一种临床常见代谢性骨病，其发病率已经跃居世界各种常见病的第7位，成为突出的社会公共卫生问题^{[1, 2]}。在各种类型的骨质疏松症当中，糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIO)是临床上最常见的继发性骨质疏松症，由于其严重影响患者的生活质量，已引起人们的普通关注^{[3, 4]}，本研究根据中医学肾藏精生髓主骨理论，立足于前期研究成果和具有自主知识产权的发明专利^{[5, 6, 7]}，以骨密度及血清高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、股骨脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein,A-FABP)等脂类代谢指标为效应指标，探讨鹿茸提取物复方对GIO干预作用及机制，以期为骨质疏松症的干预提供实验依据，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠(上海西普尔－必凯实验动物中心)，雌雄各半，雌性体重(190±10) g，雄性体重(240±10) g，3月龄，动物许可证号：SCXK(沪)2008-0016。 1.2 主要试剂与仪器

鹿茸提取物复方：鹿茸提取物、淫羊藿提取物，微粉牡蛎(辽宁中医药大学分子生物学实验室)，骨疏康颗粒(辽宁康辰药业，080729)，TaKaRa RNA PCR试剂盒、DNA Marker DL2000、A-FABP引物(大连TaKaRa宝生物公司)，Trizol(加拿大BioBasielne公司)，兔抗大鼠A-FABP I抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔lgG(北京中山生物公司)。日立7600-020全自动生化分析仪(日本日立公司)，Chemi Imager 5500 凝胶电泳成像分析系统(美国 Alphainnotechchemi Imager公司)，XR-26型双能X线骨密度仪(美国NORLAND公司)，UV300紫外分光光度计(英国 UV-visible Spectrometer公司)，PowerPac200 电泳仪(美国 BIO-RAD公司)，Prism7500 型 PCR 扩增仪(美国应用生物 ABI 公司)。 1.3 分组与处理

将大鼠按体重随机分为对照组(n=22)、模型组(n=21)、鹿茸组(n=18)与骨疏康组(n=18)，除对照组外，其余3组大鼠均给予地塞米松后肢臀部肌肉注射(2.5 mg/kg，每周2次)，鹿茸组与骨疏康组大鼠分别灌胃给予鹿茸提取物复方0.439 g/kg、骨疏康颗粒2.1 g/kg，对照组、模型组大鼠给予等体积生理盐水，灌胃容积为 10 ml/kg，连续9周后，采集标本待测。 1.4 指标与检测 1.4.1 股骨骨密度测定

取大鼠左后肢股骨，用骨密度仪进行大鼠离体股骨上1/3 骨密度检测，应用The Small Subject Scout Scan软件，进行数据分析。 1.4.2 血清HDL-C含量测定

取大鼠腹主动脉血5~8 mL，3 000 r/min 离心10 min，取血清分装，应用全自动生化分析仪测定血清HDL-C含量。 1.4.3 骨组织A-FABP mRNA表达测定

取大鼠右后肢股骨头100 mg，按照Trizol试剂说明书提取总RNA，采用紫外分光光度法测定并计算OD260/OD280值，在100 μL逆转录反应体系中逆转录合成cDNA并进行PCR扩增。在 Gene Bank 中查找A-FABP基因全序列，使用 Prime 5.0 软件设计引物。A-FABP上游引物为5′-TGGGAGTTGGCTTCG-3′；下游引物为5′-CCACCATCCAGGGTTAT-3′；扩增片段199 bp。以β-actin基因作为内参照，其上游引物为5′-CGTGCGTGACATTAAAGAG-3′；下游引物为5′-TTGCCGATAGTGATGACCT-3′；扩增片段132 bp。在(50 μL)PCR 反应体系中进行扩增，扩增条件为94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 min、57 ℃ 30 min、72 ℃ 1 min，30 个循环，72 ℃终延伸10 min。通过软件计算所有样品的Ct值，结果采用2^－ΔΔCt法进行相对基因表达分析。 1.4.4 骨组织A-FABP蛋白表达测定

另取100 mg股骨头，细胞裂解法提取总蛋白，酚试剂法测定蛋白浓度，以最低浓度的样品为基础，用裂解缓冲液把各样品调整至相同蛋白浓度，一抗、二抗孵育，酶显法显色，采用Chemi Imager 5500 凝胶电泳成像分析系统成像。以β-actin为内参照，运用Scion Image软件对蛋白电泳带进行灰度值检测。以目标蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值表示目标蛋白表达水平。 1.5 统计分析

数据以(x±s)表示，采用 SPSS 15.0统计软件对数据进行统计分析，先行正态及方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法(least-significant difference，LSD)，检验水准α=0.05。 2 结 果 2.1 各组大鼠股骨骨密度及血清HDL-C变化(表 1)

与对照组比较，模型组大鼠骨密度、HDL-C含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，鹿茸组大鼠骨密度、HDL-C含量明显增加(P<0.01)，骨疏康组大鼠骨密度、HDL-C含量虽有增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表 1

表 1 各组大鼠股骨骨密度、血清HDL-C含量比较(x±s，n=9) 组别 骨密度(g/cm2) HDL-C(mmol/L) 雄性 雌性 雄性 雌性 对照组 0.113±0.006 0.119±0.010 0.521±0.009 0.485±0.017 模型组 0.105±0.003a 0.111±0.008a 0.349±0.019a 0.355±0.015a 鹿茸组 0.111±0.005b 0.119±0.010b 0.483±0.017b 0.509±0.029b 骨疏康组 0.108±0.005 0.112±0.006 0.390±0.009a 0.376±0.021a 注：与对照组比较，a P<0.01；与模型组比较，b P<0.01。

表 1 各组大鼠股骨骨密度、血清HDL-C含量比较(x±s，n=9)

与对照组比较，模型组大鼠股骨A-FABP mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01)；与模型组比较，鹿茸组和骨疏康组大鼠股骨A-FABP mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01)。

表 2

表 2 各组雌雄大鼠股骨A-FABP mRNA和蛋白表达比较(x±s，n=6) 组别 mRNA 蛋白 雄性 雌性 雄性 雌性 对照组 1.048±0.413 1.025±0.287 7.447±1.047 7.249±0.329 模型组 2.188±0.133a 3.594±0.638a 8.877±1.341a 8.951±1.468a 鹿茸组 1.203±0.132b 1.496±0.537b 7.736±0.883b 7.199±0.969b 骨疏康组 1.433±0.258b 3.001±0.211b 8.313±0.923ab 7.347±1.445b 注：与对照组比较，a P<0.01；与模型组比较，b P<0.01。

表 2 各组雌雄大鼠股骨A-FABP mRNA和蛋白表达比较(x±s，n=6)

本研究采用糖皮质激素诱导法制作肾虚骨质疏松症大鼠模型^[8]，以鹿茸提取物复方作为干预因素，以国准字号药物骨疏康颗粒为阳性对照,探讨了大鼠脂类代谢异常与GIO的相关性以及鹿茸提取物复方对脂类代谢异常的调节作用，结果表明：与对照组比较，模型组大鼠骨密度明显降低，提示本研究中糖皮质激素诱导骨质疏松模型成功；与模型组比较，鹿茸提取物组大鼠骨密度显著增加，提示鹿茸提取物复方对骨质疏松大鼠骨质疏松症具有较好的干预作用。

脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)是脂肪酸结合蛋白超家族成员之一，其作为细胞内、外的脂肪酸受体，对促进脂肪酸及其衍生物的摄取起着重要作用。研究发现^{[9, 10]}，A-FABP与糖尿病、肥胖症等多种脂类代谢异常疾病存在密切关系，而骨质疏松症的机制之一是骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化异常。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠骨组织A-FABP表达增强，血清HDL-C明显降低，提示地塞米松、A-FABP及HDL-C与骨质疏松存在相关，骨组织A-FABP升高、血清HDL-C降低可能是糖皮质激素性骨质疏松症的发病机制之一；与模型组比较，鹿茸提取物组大鼠A-FABP表达降低，HDL-C明显升高，提示鹿茸提取物复方能在一定程度上调节脂类代谢异常，调节成脂分化异常，进而促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。鹿茸提取物复方对大鼠GIO具有一定干预作用，其机制可能与降低大鼠血清中HDL-C含量、升高骨组织A-FABP表达有关。