非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪蓄积为特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝纤维化和肝硬化^[1]。其中NASH占30%～50%，是造成非酒精性脂肪性肝硬化及其相关并发症的重要因素。白藜芦醇(3,4,5-三羟基二苯乙烯，RSV)是一种含有芪类结构非黄酮类多酚化合物，广泛存在于虎杖、葡萄、花生等多种植物中^[2]。近年研究证实白藜芦醇可在抗炎、抗氧化活性、调节脂质代谢等多方面发挥预防NAFLD作用^{[3, 4, 5]}，但具体机制尚不完全清楚。自噬作为一种大分子物质降解机制，在维持细胞内物质的再循环和调节内环境的稳态以及机体生长、发育和衰老等过程中均具有重要作用。自噬通过调节脂质代谢、减少促凋亡基因表达等发挥NAFLD干预作用^{[6, 7]}。研究表明白藜芦醇可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)和沉默信息调节因子2(silent information regulator 2，SIRT2)诱导自噬，从而减缓NAFLD进程^[8]。但作用机制还不十分清楚，本研究旨在观察白藜芦醇对MCD饮食诱导的NASH小鼠改善作用及机制，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验动物

40只雄性C57BL/6J小鼠(中山大学实验动物中心)，SPF级，许可证号：SYXK(粤)：2012-0080，6周龄，体重18～22 g，饲养条件：温度19～26 ℃，湿度40%～70%。实验前适应性喂养1周。 1.2 主要仪器与试剂

RLX800酶标仪(美国BIO-TEC公司)；光学显微镜(日本Nikon公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)。蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)；白藜芦醇、油红O(美国sigma公司)；羧甲基纤维素钠(北京普博欣生物科技有限公司)；甘油三酯(triglyceride，TG)试剂盒(日本Wako 公司)；丙二醛、血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)测试盒(美国Cayman公司)；兔抗小鼠蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)多克隆抗体、兔抗微管相关蛋白1轻链(microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3)单克隆抗体、兔抗人AMPKα多克隆抗体、兔抗人哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)多克隆抗体(美国CST公司)；过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(美国Jackson公司)。 1.3 分组与处理

40只小鼠按体重随机分为对照组、模型组、白藜芦醇低、高剂量组，每组10只。对照组喂饲基础饲料，其余各组喂饲MCD饲料。白藜芦醇低、高剂量组分别每天给予100、250 mg/kg的RSV灌胃，对照组和模型组给予等量0.5%羧甲基纤维素钠溶液，连续4周。实验期间，小鼠自由摄食饮水。 1.4 指标与方法

实验期间记录小鼠体重及一般状况；4周后，小鼠0.6％戊巴比妥腹腔麻醉(0.1 mL/100 g)，摘眼球取血，离心分离血清，试剂盒法测定血清ALT；分离肝脏，观察大体改变，石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色后于光学显微镜下观察小鼠肝脏病理改变，参照美国国立卫生研究院NASH临床研究网病理工作组指南进行NAFLD活动度积分(NAFLD activity score，NAS)评定；制作冰冻切片，油红O染色后于光学显微镜下观察肝组织脂滴形成情况；称取150～200 mg 肝组织，试剂盒法测定肝组织TG、丙二醛含量；称取50～100 mg肝组织，Western blot法进行LC3B、AMPK、Akt、mTOR蛋白表达水平测定。 1.5 统计分析

结果以x±s表示，采用SPSS 13.0建立数据库，并进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferrni法，检验水准为α=0.05。 2 结 果 2.1 小鼠一般状况

对照组小鼠皮毛整洁、有光泽，运动活泼，食量排泄物均正常；模型组小鼠毛发粗糙、色泽暗淡，活动减少；白藜芦醇组小鼠均有不同程度的活动减少，饮食稍少，皮毛欠光泽；对照组小鼠肝脏外观呈暗红色，质地柔软，弹性好，边缘锐，切面光滑；模型组小鼠肝脏体积明显增大，颜色发黄，边缘圆钝，包膜紧张，切面油腻；白藜芦醇低、高剂量组小鼠肝组织颜色、质地、大小均介于对照组和模型组之间。 2.2 白藜芦醇对小鼠体重和肝重影响

对照组、模型组、白藜芦醇低、高剂量组小鼠体重分别为(26.54±0.88)、(13.66±0.90)、(14.23±0.82)、(15.16±0.75)g，肝重分别为(1.02±0.89)、(0.61±0.09)、(0.55±0.61)、(0.57±0.84)g；模型组小鼠体重、肝重明显低于对照组(P<0.01)；与模型组比较，白藜芦醇组小鼠体重、肝重明显升高(P<0.05)。 2.3 白藜芦醇对小鼠生化指标影响(表 1)

与对照组比较，模型组小鼠血清ALT含量及肝组织TG、丙二醛含量均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，高剂量白藜芦醇组小鼠血清ALT含量、肝组织TG、丙二醛含量明显降低(P<0.01)。

表 1

表 1 白藜芦醇对小鼠ALT、TG、丙二醛含量影响(x±s，n=10) 组别(mg/kg) ALT (U/L) TG (mg/g) 丙二醛 (nmol/mgprot) 对照组 57.21±0.19 21.22±0.82 2.14±0.22 模型组 144.17±0.32a 112.77±0.88a 10.32±0.30a 白藜芦醇组  100 113.33±0.71a 85.44±0.36ab 7.19±0.68ab                       250 83.16±0.40b 40.75±0.19ab 4.61±0.58ab 注：与对照组比较，a P<0.01；与模型组比较，b P<0.01。

表 1 白藜芦醇对小鼠ALT、TG、丙二醛含量影响(x±s，n=10)

结果显示，对照组小鼠肝组织肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞无明显病变，细胞核位于细胞中央且结构清晰；模型组小鼠肝组织出现大量脂肪变性，肝细胞增大，胞浆内脂肪空泡大小不一，小叶内有小灶性炎性细胞浸润；白藜芦醇低剂量组小鼠肝组织脂肪变性较模型组减轻，胞浆内充满小脂滴，炎性细胞浸润减少；白藜芦醇高剂量组小鼠可见肝脏轻度脂肪变，肝小叶未见明显炎性细胞浸润。对照组、模型组、白藜芦醇低、高剂量组小鼠肝组织NAS积分分别为(1.45±0.11)、(6.06±0.21)、(3.93±0.22)、(1.97±0.21)分。与对照组比较，模型组NAS积分明显增高(P<0.01)；与模型组比较，白藜芦醇组小鼠肝组织NAS积分明显降低(P<0.05)。

图 1

图 1 白藜芦醇对小鼠肝组织病理结构影响(HE，×400)

光镜下可见对照组小鼠肝组织有少量红色脂滴，而模型组小鼠肝组织可见大量橘红色脂滴形成，白藜芦醇低剂量组小鼠肝组织红色脂滴数量和体积较模型组均明显减少、变小，白藜芦醇高剂量组小鼠肝脏只见少量较小红色脂滴形成。 2.6 白藜芦醇对小鼠LC3、AMPK、Akt、mTOR蛋白表达影响(表 2、图 2)

与对照组比较，模型组LC3Ⅱ表达水平明显升高(P<0.05)；模型组小鼠肝组织AMPK表达水平较对照组明显增加(P<0.01)；与模型组比较，高剂量白藜芦醇组小鼠AMPK表达水平明显上调(P<0.01)；与对照组比较，模型组小鼠肝组织Akt和mTOR水平降低(P<0.05)；与模型组比较，高剂量白藜芦醇组小鼠肝组织Akt和mTOR水平均上调。

表 2

表 2 白藜芦醇对小鼠肝组织LC3Ⅱ及通路蛋白表达影响(xs，n=10) 组别(mg/kg) LC3Ⅱ AMPK Akt mTOR 对照组 0.98±0.07 1.02±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 模型组 1.27±0.01a 1.81±0.09b 0.75±0.02a 0.58±0.04b 白藜芦醇组  100 1.34±0.07 0.96±0.78c 0.34±0.18c 0.68±0.13                       250 2.25±0.14c 3.01±0.16c 1.20±0.07c 1.32±0.14c 注：与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01；与模型组比较，c P<<0.01。

表 2 白藜芦醇对小鼠肝组织LC3Ⅱ及通路蛋白表达影响(xs，n=10)

图 2

注：1：对照组；2：模型组；3、4：白藜芦醇低、高剂量组。 图 2 白藜芦醇对小鼠肝组织LC3及通路蛋白表达影响

研究表明MCD饮食诱导雄性C57BL/6J小鼠模型是经典的NASH模型，最接近于人的组织学特征^[9]。本研究结果显示，小鼠肝脏大体观察及肝组织病理形态均发生了明显改变，血清ALT和肝组织TG明显高于对照组，提示NASH模型构建成功。研究发现，白藜芦醇能够明显改善高脂饮食诱导的脂代谢紊乱和氧化应激水平，可有效改善高脂饲料喂养 C57BL/6J 小鼠脂代谢异常，其机制可能与促进肝脏SIRT1和LXRα表达有关^[10]。本研究结果显示，白藜芦醇干预可以减轻小鼠的体重下降，改善肝脏脂肪变性，可以减轻肝脏脂肪变性和炎性细胞浸润，明显降低血清ALT、肝组织TG和MDA水平。

自噬是真核细胞中普遍存在的一种物质降解途径，通过自噬-溶酶体介导，净化自身多余或受损的细胞器，以维持细胞内物质的再循环和调节内环境稳态，对机体生长、发育和衰老均起重要作用^{[11, 12]}。自噬通过自噬-溶酶体途径吞噬并降解脂滴从而调节细胞脂代谢和脂质沉积，减缓NAFLD进程。脂肪变性、高胰岛素血症等均可引起肝细胞自噬功能受损，而自噬功能受损反过来又会加重NASH。因此，提高细胞内自噬功能对于治疗NAFLD具有重要意义。本研究结果显示，MCD饮食喂养4周后，小鼠肝脏自噬体标志性蛋白LC3的表达量明显升高，提示MCD可以诱导肝细胞内自噬；与模型组比较，白藜芦醇组小鼠肝脏LC3表达量明显增加。自噬受很多细胞内信号通路调节，比较经典的是AMPK通路，而Akt/mTOR则是负向调节自噬^[13]。进一步检测通路蛋白的表达发现，与模型组比较，白藜芦醇组小鼠肝脏AMPK水平明显上调，而Akt/mTOR水平未明显下调，提示白藜芦醇诱导的自噬可能是受AMPK通路调节。