中国公共卫生  2015, Vol. 31 Issue (1): 76-79   PDF    
引用本文
王飞清, 余司文, 夏曙华, 徐静峰, 邹文兵, 王世君, 崔淼淼, 喻茂娟. 燃煤型氟中毒对雌鼠卵巢生殖功能影响[J]. 中国公共卫生, 2015, 31(1): 76-79.
WANG Fei-qing, YU Si-wen, XIA SHU-hua, et al. Effects of fluorosis caused by coal-burning on ovarian reproductive function in female rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2015, 31(1): 76-79.
燃煤型氟中毒对雌鼠卵巢生殖功能影响
王飞清1, 余司文2, 夏曙华1,3 , 徐静峰4, 邹文兵1, 王世君3, 崔淼淼4, 喻茂娟5    
1. 贵阳医学院检验学院, 贵州 贵阳 550004;
2. 上海市闸北区中心医院;
3. 贵阳医学院附属医院;
4. 贵阳市第二人民医院;
5. 贵阳医学院公共卫生学院
数字出版日期：2014-4-8 14:06
基金项目：贵州省科技厅项目[黔科合LG字(2011036);黔科合J字(20112277)];教育部财政部(教高函200918)
作者简介：王飞清(1988-),男,江西湖口人,硕士在读,研究方向:地方病和生殖医学。
通讯联系人：夏曙华,E-mail:xsh523@126.com
摘要：目的 动态观察燃煤型氟中毒对雌鼠卵巢生殖功能影响。方法 SD雌鼠自由食用织金病区原煤烘烤的玉米饲料复制燃煤型氟中毒动物模型;动态观察雌鼠染氟期间牙齿的变化情况;测定大鼠尿氟、骨氟含量;分离卵巢计算卵巢系数,光镜下观察卵巢组织形态、各级卵泡及黄体的数量变化;于不同时间段(60、120、180 d)动情期处死雌鼠,分离血清,放射免疫法检测血清中雌二醇含量。结果 与对照组比较,随染氟时间增加,染氟组雌鼠尿氟与骨氟含量明显升高,呈时间效应关系;各染氟组雌鼠卵巢卵泡颗粒细胞呈现渐进性水肿变化,闭锁卵泡和黄体退化逐渐增多,成熟卵泡偶见;与对照组比较,中氟组雌鼠染氟180 d闭锁卵泡数量[(24.700±4.138)个]与高氟组雌鼠染氟120、180 d时闭锁卵泡数量[分别为(24.200±3.706)、(25.000±4.714)个]明显升高(P<0.05);与对照组比较,染氟60 d时,中、高氟组雌鼠血清中雌二醇含量[分别为(43.875±7.180)、(45.625±5.780)pmol/L]升高(P<0.05)。结论 燃煤型氟中毒对雌鼠卵巢具有毒性作用,其机制可能与加速各级卵泡退化、闭锁、导致卵泡颗粒细胞水肿、卵泡细胞受损,进而影响雌二醇合成和分泌有关。
关键词： 燃煤型氟中毒     雌鼠     卵巢     生殖功能    
Effects of fluorosis caused by coal-burning on ovarian reproductive function in female rats
WANG Fei-qing1, YU Si-wen2, XIA SHU-hua1,3 , et al    
Department of Laboratory Medicine, Guiyang Medical College, Guiyang, Guizhou Province 550004, China
Abstract: Objective To observe influences of fluorosis caused by coal burning on ovarian reproductive function in female rats.Methods Female Sprague-Dawley rats in experiment group were fed with corn roasted with raw coal from Zhijin area,an endemic fluorosis area,to establish an animal model of coal-burning fluorosis.The changes of the teeth of the female rats during fluorine exposure was observed.Fluorine contents of urine and bone were detected.The ovaries of the rats were collected and ovary coefficient was calculated;the pathological morphology of ovary,the changes of ovarian follicles at different development stage,and the number of corpus luteum were observed with light microscope.Estrus female rats were sacrificed at different time(60,120,180 days)of the fluoride exposure to collect serum samples for the determination of estradiol(E2)with radioimmunoassay.Results Compared with the control group,the fluorine contents of urine and bone increased significantly with the increment of fluoride exposure time in the experiment group.In the fluoride exposure group,all follicular granulosa cells showed progressive edema;atresia of the follicle and degradation of corpus luteum increased gradually and mature follicle were observed occasionally.Compared with the control group,the number of atresia follicles significantly increased in moderate fluoride exposure group(24.000±4.138 at 180 day)and in high fluride exposure group(24.200±3.705 at 120 day and 25.000±4.714 at 180 day)(P<0.05 for all).Compared with the control group,serum estradiol levels in the rats in moderate fluoride exposure group(43.875±7.180 pmol/L)and high fluoride exposure group(45.625±5.780 pmol/L) increased at 60 day of the experiment(P<0.05 for all).Conclusion There are toxic effects of coal-burning fluorosis on the ovary of female rasts and the mechanism of the effects is related to the increases of follicle degeneration and atresia of follicles at different stages,follicular granulosa cell edema,damage of follicular cells,and the impaired synthesis and secretion of E2.
Key words: coal-burning fluorosis     female rat     ovary     reproductive function    

燃煤型氟中毒是中国常见地方病之一,发现于20世纪70年代末,主要引起牙齿和骨骼损伤。近几年随着氟损伤机理的不断深入研究,氟对非骨相组织的损害日益引起了人们重视,尤其是对生殖系统的损害[1]。但目前的研究主要是针对雄性生殖毒性[2, 3, 4],氟对雌性生殖毒性作用研究较少见。为探讨氟中毒对卵巢生殖毒性作用,本研究以SD雌鼠为实验对象,复制雌鼠燃煤型氟中毒模型,动态观察氟中毒对雌鼠卵巢生殖功能的影响,并初步探讨其可能机制,结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂

PXJ-1B型数字式离子计(江苏江分店精密分析仪器有限公司);pF-1型氟离子选择性电极(上海精密科学仪器有限公司);OLYMPUS BX51双目光学显微镜(日本奥林巴斯光学工业株式会社);CN202M/KZ4GC-911型放射免疫分析仪(西化仪北京科技有限公司);雌二醇放射免疫分析试剂盒(天津九鼎医学生物工程有限公司);氟化钠(成都金山化学试剂有限公司)。 1.2 实验动物分组及处理

SD雌性大鼠[贵阳医学院动物实验中心,SCXK(黔)2012-0001]90只,断乳2周,体重60~80 g,适应性喂养1周,按体重随机分为对照组、中、高氟组,每组30只,每周调整鼠笼位置,力求各组雌鼠实验条件一致,自由饮用自来水,自由食用织贵州省金病区原煤加拌泥煤烘烤的玉米饲料[5],对照组大鼠食用非病区玉米饲料,含氟量为5.2 mg/kg;中、高氟组饲料中含氟量为47.8、96 mg/kg。分别于染氟第60、120、180 d处死雌鼠,每次处死之前连续10 d每天早上对雌鼠进行阴道脱落细胞涂片,观察动情周期变化,于动情期处死雌鼠。 1.3 指标与方法 1.3.1 氟斑牙发生情况

处死动物时观察雌鼠有无氟斑牙形成,氟斑牙分度标准[6]:轻度牙表面黄白相间,白垩条纹清晰;中度牙表面呈无光泽粉笔样白色;重度牙表面出现小沟、裂纹或部分脱落,牙齿呈锯齿状严重缺损。 1.3.2 尿氟、骨氟测定

处死之前用代谢笼收集雌鼠24 h尿液,采用氟离子选择电极法测定尿氟含量。处死大鼠后,取右侧股骨,将附着的筋肉和脂肪剔除干净,于105 ℃烘箱内烘干,采用高温灰化-氟离子选择电极法检测骨氟含量。 1.3.3 卵巢脏器系数测定

分别于染氟60、120、180 d时在动情期处死雌鼠,称体重,取出卵巢组织,剔除脏器周围脂肪和结缔组织,滤纸吸干表面血液,用电子天平称双侧卵巢重量,计算脏器系数。 1.3.4 光镜观察卵巢组织形态学变化

迅速取下一侧卵巢,经10%甲醛溶液固定3 d后,常规取材、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色(hemato-xylin-eosin staining,HE),光镜400倍镜下观察卵巢组织形态学改变,每张切片随机选取20个高倍镜视野计算原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、黄体卵泡、闭锁卵泡数量变化。 1.3.5 雌鼠血清中雌二醇含量测定

采用股动脉取血法(取血时注意用干净的实验器材并把血管附近的毛发清除干净,以免引起溶血),用普通生化管收集血液7~10 mL,1 500 r/min离心10 min,分离血清,采用放射免疫法检测血清中雌二醇含量。 1.4 统计分析

数据用x±s表示,采用SPSS 17.0软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较,方差齐时采用最小显著差法,方差不齐时采用Dunnett’T3法,P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 大鼠一般状况

对照组雌鼠食欲正常,精神较好,毛色有光泽;各染氟组雌鼠食欲降低,活动减少,精神萎靡不振,毛色光泽度下降,并随染氟时间延长表现加重;对照组大鼠均无氟斑牙出现;各染氟组大鼠随染氟时间延长、染氟剂量升高,均出现不同程度的氟斑牙,且氟斑牙症状呈逐渐加重趋势。 2.2 骨氟、尿氟含量变化(表 1)

与对照组比较,染氟60、120、180 d时,染氟组雌鼠尿氟、骨氟含量均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1 各组雌鼠尿氟、骨氟含量比较(x±s,n=10)
2.3 燃煤型氟中毒对雌鼠卵巢脏器系数和血清雌二醇含量影响(表 2)

与对照组比较,染氟组雌鼠卵巢脏器系数均无明显变化;染氟60 d时,中、高氟组雌鼠雌二醇含量升高(P<0.05);染氟120、180 d时,中、高氟组雌鼠雌二醇含量逐渐降低,但差异均无统计学意义(P>0.05);随染氟时间点变化,对照组雌鼠雌二醇含量呈从低到高再降低的波动性变化。

表 2 各组雌鼠卵巢系数和E2的比较(x±s,n=10)
2.4 燃煤型氟中毒对各组雌鼠卵泡及黄体影响(图 1)

对照组雌鼠卵巢组织结构形态正常,均可见多个黄体及不同发育阶段卵泡,颗粒细胞呈单层或多层排列。随染毒剂量增加和时间延长,各染氟组雌鼠卵巢卵泡颗粒细胞呈现渐进性水肿变化,细胞结构和细胞轮廓变得模糊,闭锁的卵泡和黄体退化逐渐增多,成熟卵泡偶见。与对照组比较,染氟组雌鼠原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、黄体数量均无明显变化;染氟60、120、180 d时,对照组雌鼠闭锁卵泡数量分别为[(20.600±3.307)、(20.300±3.831)、(19.200±4.022)个],中、高氟组雌鼠闭锁卵泡数量分别为[(21.800±2.936)、(22.300±3.057)、(24.700±4.138)和(23.200±2.821)、(24.200±3.706)、(25.000±4.714)个];与对照组比较,中氟组染氟180 d与高氟组染氟120、180 d的雌鼠闭锁卵泡数量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

注：A1：对照组;A2：中氟组(染氟180 d);A3：高氟组(染氟180 d)。 图 1 氟中毒致雌鼠卵巢颗粒细胞变化(HE,×200)
3 讨 论

化学毒物对靶器官脏器系数影响是研究其对靶器官毒性作用的重要线索。本研究结果显示,各染氟组雌鼠卵巢脏器系数与对照组比较,差异无统计学意义。与文献报道[7]结果类似,这可能与氟剂量或染氟时间尚未造成明显的卵巢器质性病理变化有关。

卵泡是卵巢的主要功能单位,卵泡细胞主要分泌雌激素,有文献报道过量的氟可使育龄妇女血清雌二醇含量降低[8],但雌二醇含量降低是否与过量的氟影响各级卵泡细胞的发育过程有关尚不清楚。本研究结果显示,各染氟组雌鼠卵巢卵泡颗粒细胞呈现渐进性水肿变化,细胞结构和细胞轮廓变得模糊,闭锁的卵泡和黄体退化逐渐增多。提示氟中毒对卵泡细胞存在毒性作用,且卵泡细胞受损与染毒剂量和染毒时间呈正相关。本研究结果还显示,对照组雌鼠血清雌二醇含量呈现从低到高再降低的波动性变化,这可能与雌鼠生理周期变化有关;染氟60 d时,中、高氟组雌鼠雌二醇含量随染氟剂量增加而逐渐升高,且明显高于对照组。可能与氟是机体必须元素之一,短期内给予氟可能对雌鼠卵巢雌性激素的合成和分泌有促进作用,或由于染氟时间较短,雌鼠受到氟剂量突然增加刺激,引起体内的应激反应,促使雌二醇含量增加等因素有关。提示燃煤型氟中毒可能通过对卵泡细胞的毒性作用,从而影响雌二醇的合成和分泌。

综上所述,燃煤型氟中毒对雌鼠卵巢存在毒性作用,其机制可能与染氟加速各级卵泡退化、闭锁,导致卵泡颗粒细胞水肿,卵泡细胞受损,影响雌二醇合成和分泌,从而可能导致排卵功能下降,最终影响卵巢的生殖功能有关。氟中毒导致卵泡颗粒细胞损伤和E2的分泌异常是否与其对卵巢细胞的凋亡、调节因子、性腺轴的激素调节等因素影响有关有待进一步研究。

参考文献
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