霍乱弧菌(Vibrio cholerae)分为产毒株和非产毒株^[1]，前者携带表达致病毒素的毒力基因，易引起暴发流行，是严重威胁公众生命健康的主要传染源，针对毒素的检测有助于诊断病原、判定疫情发展态势和采取适当有效的防制策略和措施。霍乱肠毒素(Cholera entero toxin，CT)是主要的致病因子，其编码基因(Cholera entero toxin A，ctxA)是霍乱弧菌染色体CTX遗传单元的组成成分，在不同血清群和生物型间高度保守，是诊断产毒菌株的首选目的基因。应用环介导等温扩增技术^[2](loop-mediated isothermal amplification,LAMP)在食源性致病菌的快速检测上已有一些实践^{[3, 4, 5]}，本研究建立的食品中霍乱弧菌毒力基因LAMP快速检测方法，可在2 h内获得检测结果，适合于现场应急使用并在基层普及推广，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

菌株：霍乱弧菌、沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、变形埃希菌、单核细胞增生李斯特菌、肠出血性大肠埃希菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽孢杆菌、溶血性链球菌、气单胞菌(无锡市疾病预防控制中心保藏)。引物由上海生工生物工程有限公司合成；Bst DNA 聚合酶、10×thermo pol buffer(美国New England Bio-labs 公司)；甜菜碱(美国Sigma公司)；MgCl₂、dNTP mixture、100 bp DNA ladder Marker(大连宝生物有限公司)；琼脂糖(美国 Promega 公司)；培养基(北京陆桥技术有限公司)。Master cycler^ep gradient S PCR 扩增仪(德国 Eppendorf 公司)、水平电泳仪(美国Bio-RAD公司)、Tanon 4100 型凝胶成像系统(上海天能公司)。 1.2 LAMP方法建立 1.2.1 细菌DNA模板提取

取细菌纯培养物1 mL，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入100 μL DNA提取液，充分悬浮混匀，100 ℃水浴10 min。10 000 r/min 离心1 min，取上清于-20 ℃保存备用。 1.2.2 引物设计与合成

根据GenBank中霍乱弧菌毒素基因ctxA保守序列，用 Primer Expolrer 4.0软件在线设计出4条LAMP 引物，包括2条外引物F3和B3和2条内引物FIP和BIP，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。序列如下：F3：5′-CGTATGAGGCGCATAGAGTT-3′；B3：5′-CGAGCCT-ATCGTTAAGCT-3′；FIP5′-：GAATGGTGAACACCATCCCATGCTACTGATCGTGTACATCTAGAACA-3′；BIP：5′-CGAGGTTCTAGTACATATAGCAA-GCTCAGCTCCTGCTGCTAAT-3′。 1.2.3 LAMP反应体系及其优化

反应体系25 μL，内含外引物(F3、B3)、内引物(FIP、BIP)、10×ThermoPol buffer、dNTPs、MgCl₂、甜菜碱、Bst DNA 聚合酶、ddH₂O 和 DNA 模板，反应条件：65 ℃ 60 min，80 ℃ 10 min终止反应。分别优化内外引物浓度比、dNTPs浓度、Mg²⁺浓度，确定最佳反应条件。 1.2.4 结果判断

LAMP扩增产物可肉眼观察反应体系浊度的变化，或加入1 μL 荧光染料1 000×SYBR GREEN I，观察颜色变化，或2.0 %琼脂糖凝胶电泳，观察电泳条带。 1.2.5 特异性试验

对霍乱弧菌、沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌、肠出血性大肠埃希菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽孢杆菌、溶血性链球菌、气单胞菌12种常见食源性致病菌均用设计好的LAMP引物进行扩增，验证引物的特异性。 1.2.6 灵敏度试验

挑取霍乱弧菌培养物至灭菌生理盐水中，比浊法估计菌浓度为10⁸ cfu/mL，用灭菌生理盐水10倍梯度稀释至10⁰ cfu/mL，从各浓度稀释液取1 mL接种平板，菌落计数确定菌浓度。取各浓度稀释液直接制备模板，LAMP反应后电泳检测，能检出的最低细菌浓度为该体系的检测灵敏度。 1.3 模拟样品检测

随机采集市售鱼肉样品10份，经国标法验证均不含沙门菌。挑取细菌培养物至5 mL灭菌生理盐水中，麦氏比浊法估计菌浓度为10⁸ cfu/mL，各称取10 g鱼肉样品加入不同试管，将菌液2 mL与各样品混合并补加灭菌生理盐水至20 mL，均质混匀。用灭菌营养肉汤从10⁷ cfu/g开始倍比稀释至10⁰ cfu/g，取各浓度稀释液平板计数。各取1 mL提取DNA，LAMP扩增后电泳分析。 1.4 实际样品检测

对采集市场、食品污染物监测样品和历年来本实验室收集保存和相关单位惠赠的食物中毒样品DNA共计16份采用LAMP方法进行检测，所有样品均同时采用卫生部标准方法WS 289-2008复核。 2 结 果 2.1 LAMP检测方法建立(图 1)

针对霍乱弧菌ctxA基因进行LAMP扩增，凝胶上显示LAMP反应典型的阶梯形条带，阴性对照无条带出现；分别加入1 μL 荧光染料1 000×SYBR GREEN I，发现阳性反应管中液体变绿色，而阴性对照管呈现橙色，表明建立的LAMP方法有效可行。通过单因素优化实验改进反应参数，确定LAMP最佳反应条件：8.0 mmol/L Mg²⁺、0.6 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L FIP和BIP、0.2 μmol/L F3和B3。

图 1

注：1：100 bp DNA Marker；2~7：霍乱弧菌；8：阴性对照。 图 1 霍乱弧菌LAMP检测电泳结果

用优化的LAMP 反应体系对所收集到的实验菌株进行特异性验证，部分验证结果见图 2。电泳结果显示，霍乱弧菌均出现梯状条带呈现阳性反应，其他菌株无条带为阴性，表明所建立的LAMP方法能特异性地检测霍乱弧菌。

图 2

注：1、16：100 bp DNA ladder Marker；2~13：分别为霍乱弧菌、沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、变形杆菌、肠出血性大肠埃希菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽孢杆菌、溶血性链球菌、气单胞菌；14：阳性对照；15：阴性对照。 图 2 霍乱弧菌LAMP特异性验证结果

通过平板计数法确定霍乱弧菌原始菌液浓度为2.4×10⁸ cfu/mL，10倍倍比稀释成梯度菌液，分别提取DNA进行LAMP扩增，结果显示，稀释浓度为2.4×10⁰ cfu/mL 时无电泳条带，表明LAMP法检测灵敏度为2.4×10¹ cfu/mL。

图 3

注：1：100 bp DNA ladder Marker；2~8：2.4×107~2.4×101 cfu/mL；9：阴性对照。 图 3 霍乱弧菌LAMP灵敏度结果

霍乱弧菌菌液人工污染猪肉制备的模拟样品经平板计数测得浓度为6.3×10⁸ cfu/g，10倍梯度稀释后LAMP检测，电泳结果显示，稀释到10² cfu/g时还出现典型的LAMP扩增条带，而10 cfu/g浓度检测结果显示阴性，表明LAMP法对污染食品中沙门菌的检测灵敏度为6.3×10² cfu/g。 2.5 实际样品检测应用

采用LAMP技术对市场采集、食品污染物监测样品及食物中毒样品共计16份进行检测，共检出阳性样品4份，均为食物中毒样品DNA，而食品污染物监测和市场采集样品未检出阳性。所有样品均同时采用卫生部标准方法WS 289-2008复核，LAMP与标准方法检测结果完全一致，表明LAMP 法检测结果真实可靠，能够用于日常样品和突发食源性疫情应急检测。 3 讨 论

霍乱弧菌肠毒素侵袭宿主肠粘膜上皮细胞而致病，毒力基因可通过诱导形成溶源性噬菌体在菌株间水平传递^[6]，由此导致产毒株和非产毒株的转换变异，产毒株是食品安全与环境监测的主要研究对象，分子流行病学研究表明，产毒株绝大多数具有ctxA基因，因而常被用作霍乱弧菌产毒菌株快速检测的靶基因^[7]。本研究选取ctxA基因作为LAMP检测目的基因，在其保守区设计引物，试验验证特异性较好，检测灵敏度达到2.4×10¹ cfu/mL。本研究检测出的4份ctxA基因阳性标本均为食物中毒样品，而在采自食品污染物监测和市场的样品中来检出阳性菌株，且除非有特殊培养要求，一般检测结果均可在2 h内获得，表明在日常食品安全监测和食物中毒应急处置中应用LAMP技术开展霍乱弧菌检测是切实可行的。而LAMP方法具有快速、特异、灵敏、操作简便，不需要特殊仪器，成本低廉等特点，适合于现场快速检测和基层样品初筛应用，具有较强的实际应用价值和良好的应用前景。