汉坦病毒(hantavirus，HV)属于布尼亚病毒科的汉坦病毒属，主要由啮齿类动物携带并传播给人类，引起肾综合征出血热及汉坦病毒肺综合征^[1]。在全世界范围内已发现HV至少存在>20个的血清型／基因型^[2]。而不同型别的HV由不同宿主携带，并因不同地理环境而异，特定地区宿主动物与当地流行的病毒株类型关系密切。中国至今已发现汉滩型(Hantaan virus,HTNV)、汉城型(Seoul virus,SEOV)、大别山病毒(Da Bie Shan virus,DBSV)、北海道病毒(Hokkaido virus,HOKV)、哈巴罗夫斯克病毒(Khabarovsk virus,KHAV)^[3] 、符拉迪沃斯托克病毒(Vladivostok virus,VLAV)^[3]、 沅江病毒(Yuanjiang virus,YUJV)^[4]。锦州市是辽宁省HFRS的主要疫区之一，但目前对锦州市HV基因型的分布研究鲜有报道。为进一步了解锦州市出血热的疫情动态、流行规律及宿主动物构成和感染情况，掌握锦州市HV的流行情况及基因特征，开展宿主动物HV的分子流行病学调查，现将2008—2013年结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 标本采集

2008—2013年，每年春秋(3～4月、9～10月)于锦州野外及居民区2个监测点采用夹夜法捕鼠，无菌解剖取其肺脏，置于液氮保存待检。 1.2 主要试剂与仪器

病毒RNA 提取试剂盒QIAGEN Rneasy Mini Kit；PeQSTAR 型PCR 扩增仪(德国PEQLAB GmbH 公司)；Biospectrum-AC 型自动凝胶成像仪(美国UVP公司)。 1.3 间接免疫荧光法(IFA)测鼠肺HV抗原^[5]

检测中所用HFR患者血清由锦州市疾病预防控制中心微生物实验室制备保存，羊抗人免疫荧光抗体购自Sigma公司。HV抗原阳性标本用于RT-PCR扩增。 1.4 RT-PCR检测及基因分型 1.4.1 RNA提取

按试剂盒(QIAGEN Rneasy Mini Kit)说明书提取病毒RNA，用40 μL无RNA酶的去离子水溶解，-70 ℃保存备用。 1.4.2 引物与RT-PCR扩增

AMV反转录酶反转录得到cDNA，采用HV通用M片段外引物HV-MOF(5′-GGACCTGGTGCCAGTTGTGAAGC-3′)和HV-MOR(5′-ACCTCACAAACCATTGAACC-3′)进行扩增，循环参数为42 ℃，45 min；94 ℃，4 min；94 ℃，30 s、52 ℃，30 s、72 ℃，30 s，共35个循环，最后于72 ℃延伸10 min。M基因目的片段为490 bp，位于1 190~1 680 bp，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳观察。 1.4.3 产物的回收和序列测定

按照Axygen胶回收试剂盒方法回收目的片段，并与pMD18-T载体连接，连接产物转入E.coli菌株DH5ɑ，挑单克隆，提取质粒(Axygen质粒提取试剂盒)，用EcorⅠ、XhoⅠ酶切鉴定正确，并送上海生工生物技术有限公司测序。 1.5 统计分析

用DNAStar软件进行基因序列排序及同源性分析，用MEGA5.0软件进行系统发生分析，以最大似然法(ML)构建系统发生树。分析采用1 000个多序列组。用于比较分析的HV序列来自于GenBank已知序列。 2 结 果 2.1 HV抗原的检测

2008—2013年共捕获啮齿类动物1 838只，共2科4属5种，分别是褐家鼠、小家鼠、黑线姬鼠、黑线仓鼠、大仓鼠。优势种在居民区为褐家鼠，在野外为黑线姬鼠。采用IFA法检测所有鼠肺样品，共检出HV抗原阳性鼠肺样品78份，病毒携带率为4.24％(78/1 838)。2008—2013鼠带毒率分别为6.20%(23/371)、4.32%(81/185)、1.31%(4/305)、2.82%(10/1 354)、5.65%(17/301)、4.97%(16/322)，各年之间鼠肺带毒率有统计学意义(χ²=13.579，P=0.019)。依据来源于不同时间点、不同区域、不同鼠种分为11个毒株，即JZ2008-12、JZ2011-19、JZ2011-41、JZ2012-37、JZ2013-04、JZ2013-37共6只家鼠及JZ2008-Y50、JZ2009-Y2、JZ2010-Y35、JZ2011-Y26、JZ2012-Y16共5只野鼠。 2.2 PCR检测结果及基因片段的同源性分析

11份HV抗原阳性样品，分别用SEOV型、HTNV型特异引物分别扩增其部分M基因片段，并进行序列测定。结果显示，11份鼠肺HV抗原阳性样品均是携带SEOV病毒，部分M片段核苷酸序列的同源为96.2％～100％。进一步分析发现，这11株病毒与褐家鼠携带的病毒BJHD01有最大的同源性(92.0％～93.7％)，与HTNV代表株76-118的同源性较低(70.6％～71.2％)、与DOBV的同源性为71.8％～72.6％。 2.3 系统发生分析(图 1)

用部分M片段核苷酸序列构建的系统发生树可见，所有病毒株全部位于SEOV单元群中，而且构成一个单元枝，同源性很高，变异性很小，与BJHD01株病毒进化关系最近。

图 1

图 1 用M基因片段核苷酸序列以ML法构建的系统发生树

目前锦州市流行性出血热疫区分布的鼠种有5种，优势种为褐家鼠、黑线姬鼠。随着锦州地区鼠密度和鼠带毒率的逐年增高，疫情呈散发分布，近几年来疫情有上升和向城区扩散的趋势，在锦州地区流行性出血热也正是春秋两季为发病高峰期，存在暴发流行的潜在危险，出血热疫情流行面临严峻形势。

锦州市是辽宁省乃至全国HFRS的主要疫区之一，本研究采用RT-PCR分型及核苷酸序列测定技术对锦州市流行HV的基因型进行研究，结果表明本研究中的阳性动物标本多为褐家鼠，表明褐家鼠是锦州市的优势鼠种，本研究根据M片段序列与Genebank 中已知序列进行比较并绘制系统发生树，发现锦州市SEOV序列同源性高及系统发生树都在同一进化枝上，11个病毒株苷酸序列同源性均＞95%，与其他亚型同源性大部分均＜95%，显示出HV 分布的地理聚集性。变异较小，基因型别较为稳定。

中国对SEOV的分子流行病学研究尚不系统深入。现有研究发现，尽管SEOV呈全球性分布，但与其他型的HV相比，SEOV的变异较小。而辽宁省相关研究结果显示，辽宁省SEOV均为S3亚型，锦州市11株SEO起源相同，同源性较高，尚未发现其他亚型，与周边地区葫芦岛市SEOV 核苷酸序列同源性＞98.8%，呈现出地理位置相近地区基因组序列同源性很高的特点^[6]。但孙黎等^[7]研究表明SEOV比较保守，亚型分布上呈现出明显的地理聚集性，而不同地区间仍表现出明显的遗传多样性，范飞能等^[8]研究同时发现同一地区，褐家鼠与黄胸鼠可携带不同的亚型，显示出局部地区SEOV的基因多样性。但随着监测的不断深入，锦州市仍有其他亚型存在的可能，因此，锦州市范围内系统地开展SEOV的分子流行病学研究，发现是否还存在新亚型的SEOV及其致病性，SEOV的变化规律及其进化关系，对HFRS的预防控制具有重要的指导意义。