非O1/O139群霍乱弧菌是指除O1群和O139群霍乱弧菌以外的其他霍乱弧菌的总称^[1]。以往研究认为非O1/O139群霍乱弧菌不致病或者仅引起散在的轻度腹泻。近年来，有报道发现有些非O1/O139群霍乱弧菌可产生霍乱肠毒素，从而引起人类腹泻并时有暴发流行，因此受到细菌学家和流行病学家的广泛关注^[2]。O1和O139群霍乱弧菌致病通常与CTXΦ基因元件、VPI毒力岛、毒力基因表达调控基因、细菌外膜蛋白粘附因子以及其他潜在的毒力基因相关，以往研究发现非O1/O139群霍乱弧菌也可检出上述毒力基因，但检出率报道不一^[3]。本研究收集广东省2011—2013年腹泻病例来源的20株非O1/O139群霍乱弧菌，以及同时期分离的4株海水产品来源菌株，分析其抗菌药物敏感性、毒力基因携带情况，并应用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)方法分析其分子遗传特征，为广东省霍乱预防控制提供依据。 1 材料与方法 1.1 材料

选取2011—2013年广东省腹泻监测分离的病例来源菌株20株以及同期海水产品来源菌株4株，共24株非O1/O139群霍乱弧菌。阳性对照菌株采用O1群霍乱弧菌标准株 N16961(中国疾病预防控制中心传染病所赠送)。 1.2 主要试剂与仪器

药敏纸片(英国Oxiod公司)；MH琼脂平板培养基；Taq Premix、DL2000 Marker、限制性内切酶XbaI 、Not I、琼脂糖((大连宝生物公司)；Seakem Gold低熔点琼脂糖(美国Cambrex Bio Science Rockland公司)。主要仪器包括Biometra TGradient PCR 扩增仪(德国 Biometra 公司)；电泳仪(日本 Cosmo 公司)；Gel Doc EQ 自动凝胶成像系统(美国 Bio-Rad公司)；脉冲场凝胶电泳仪(Bio-Rad CHEF Mapper)，引物序列由上海生物工程有限公司合成。 1.3 方法 1.3.1 药物敏感试验

采用WHO 推荐的改良K-B纸片法。抗菌药物包括氨苄西林(AMP,10 μg)、四环素(TCY,30 μg)、复方新诺明(SXT,1125,23 μg)、氯霉素(CHL,30 μg)，美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐，抑菌圈判定标准参照文献^[4];多西环素(DOX,30 μg)、诺氟沙星(NOR,10 μg)、环丙沙星(CIP,5 μg)、阿米卡星(AMK，30 μg),药敏实验操作和抑菌圈判定标准参照文献^[5];头孢噻肟(CTX,30 μg)、头孢曲松(CRO,30 μg)、萘啶酸(NAL,30 μg),本实验室内部监测药物。抑菌圈判定标准参考文献^[4]。质控菌株采用大肠埃希菌ATCC25922(购自美国美国菌种保藏中心ATCC)。 1.3.2 基因组DNA提取

用煮沸法提取菌株核酸,挑取纯培养的菌落至200 μL无菌水中混匀，煮沸15 min后立即转移至冰上5 min，10 000 r/min离心10 min后取上清，-20 ℃保存。 1.3.3 毒力基因的多重PCR测定(表 1)

用多重PCR扩增霍乱弧菌CTXΦ基因元件(ctxA、zot、ace)，VPI毒力岛(tcpA、tcpI)，毒力基因表达调控基因(toxR)，细菌外膜蛋白粘附因子(ompU)以及其他潜在的毒力基因(hlyA、st、mshA、TTSS、chxA)等12种毒力基因^{[6, 7, 8]}。各毒力基因引物序列见表 1。PCR 反应体系为 25 μL，内含 12.5 μL Taq Premix(2×)，上、下游引物各1 μL，模板 DNA 1 μL。设立空白对照(试剂)和阳性对照(N16961)。扩增产物用0.5×Tris-borate-EDTA配制的 1%的琼脂糖凝胶中电泳，以 DL 2000 Marker为参照，电泳后的胶块于自动凝胶成像系统中观察记录结果。

表 1

表 1 12种毒力基因引物序列、产物长度及扩增条件 引物名称 引物序列(5′一3′)产物长度 扩增条件(bp) ctxA-F CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG 542 94 ℃，2 min；94 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃， ctxA-R CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC 1 min，25个循环，72 ℃，3 min tcpA-F CACGATAAGAAAACCGGTCAAGAG 620 94 ℃，2 min；94 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃， tcpA-R TTACCAAATGCAACGCCGAATG 1 min，25个循环，72 ℃，3 min OmpU-F ACGCTGACGGAATCAACCAAAG 869 94 ℃，2 min；94 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃， OmpU-R GCGGAAGTTTGGCTTGAAGTAG 1 min，25个循环，72 ℃，3 min ace-F TAAGGATGTGCTTATGATGGACACCC 289 94 ℃，2 min；94 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃， ace-R CGTGATGAATAAAGATACTCATAGG 1 min，25个循环，72 ℃，3 min hlyA-F GGCAAACAGCGAAACAAATACC 738 94 ℃，2 min；94 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃， hlyA-R CTCAGCGGGCTAATACGGTTTA 1 min，25个循环，72 ℃，3 min tcpI-F TAGCCTTAGTTCTCAGCAGGCA 862 94 ℃，2 min；94 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃， tcpI-R GGCAATAGTGTCGAGCTCGTTA 1 min，25个循环，72 ℃，3 min toxR-F CCTTCGATCCCCTAAGCAATAC 779 94 ℃，2 min；94 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃， toxR-R AGGGTTAGCAACGATGCGTAAG 1 min，25个循环，72 ℃，3 min St-F GAGAAACCTATTCATTGC 216 94 ℃，2 min；94 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃， St-R GCAAGCTGGATTGCAAC 1 min，25个循环，72 ℃，3 min zot-F TCGCTTAACGATGGCGCGTTTT 947 94 ℃，2 min；94 ℃，1 min，50 ℃，1 min，72 ℃， zot-R AACCCCGTTTCACTTCTACCCA 1 min，25个循环，72 ℃，3 min mshA-F CGCACAATGAGGTTCGCCAAG 512 94 ℃，5 min；94 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃， mshA-R CCGAAAATTGACCGCCATTATC 45 s，30个循环，72 ℃，5 min TTSS(vcsV2)-F ATGCAGATCTTTTGGCTCACTTGATGGG 742 94 ℃，5 min；94 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃， TTSS(vcsV2)-R ATGCGTCGACGCCACATCATTGCTTGCT 45 s，30个循环，72 ℃，5 min chxA-F TGTGTGATGATGCTTCTGG 2 000 94 ℃，5 min；94 ℃，30s，52 ℃，30 s，72 ℃， chxA-R TTATTTCAGTTCATCTTTTCGC 1 min，30个循环，72 ℃，7 min

表 1 12种毒力基因引物序列、产物长度及扩增条件

24株测试菌的分型参照国际致病菌分子分型实验室监测网络PulseNet International制订的“霍乱弧菌脉冲场凝胶电泳PFGE标准操作方案”^[9]进行。DNA分子量标准为沙门菌H9812。霍乱弧菌选用限制性内切酶 Not I 酶切，200 μL 体系，酶切4 h，37 ℃。Marker沙门菌 H9812选择Xba I 酶切，其余参数与霍乱弧菌菌株相同。电泳条件为:电泳程序首先为6.0 V/cm，2～10 s，120 °夹角，13 h;其次为6.0 V/cm，20 s～25 s，120 °夹角，6 h。完成PFGE图谱，并利用BioNumerics软件(Applied Maths BVBA)分析图谱，得到菌株带型相似性的聚类分析树图。 2 结 果 2.1 抗菌药物敏感性情况(表 2)

对24 株非O1/O139 群霍乱弧菌进行了11 种抗菌药物敏感性试验，结果显示，复方新诺明的耐药率最高，萘啶酸和四环素为中等耐药，多西环素、氨苄西林、氯霉素和头孢噻肟有低度耐药，头孢曲松和阿米卡星则完全敏感，一部分菌株对氯霉素和四环素中度敏感。

表 2

表 2 非O1/O139群霍乱弧菌抗菌药物敏感性试验 抗生素 耐药 中敏 敏感 株 % 株 % 株 % 复方新诺明 17 70.8 0 0.0 7 29.2 萘啶酸 9 37.5 2 8.3 13 54.2 环丙沙星 0 0.0 1 4.2 23 95.8 诺氟沙星 0 0.0 1 4.2 23 95.8 四环素 5 20.8 5 20.8 14 58.4 多西环素 2 8.3 1 4.2 21 87.5 氯霉素 1 4.2 7 29.0 16 65.0 头孢噻肟 1 4.2 0 0.0 23 95.8 头孢曲松 0 0.0 0 0.0 24 100.0 氨苄西林 2 8.3 0 0.0 22 91.7 阿米卡星 0 0.0 0 0.0 24 100.0

表 2 非O1/O139群霍乱弧菌抗菌药物敏感性试验

20株分离自病例的菌株中，耐多药13株，耐多药率为65%；其中1株对复方新诺明和萘啶酸双重耐药，1株对复方新诺明和四环素双重耐药，3株对复方新诺明、萘啶酸和氯霉素三重耐药，2株对复方新诺明、四环素和氯霉素三重耐药，2株对复方新诺明、萘啶酸和四环素三重耐药，1株对复方新诺明、氯霉素和四环素三重耐药，1株对萘啶酸、氯霉素和四环素三重耐药，1株对复方新诺明、四环素、萘啶酸、诺氟沙星和环丙沙星五重耐药，1株对复方新诺明、四环素、萘啶酸、氯霉素和头孢噻肟五重耐药；4株海水产品来源的菌株中，耐多药1株，耐多药率为25%，表现为复方新诺明、四环素和氯霉素三重耐药。 2.3 菌株毒力基因特征

对24株非O1/O139群霍乱弧菌进行12种毒力基因检测，所有的菌株均携带hlyA和toxR基因，与此同时，均未检出ctxA、tcpA、ace、zot、st 5种毒力基因。4株海水产品来源菌株有2株为hlyA⁺toxR⁺ompU⁺tcpI⁺mshA⁺TTSS⁺chxA⁺基因型，1株为hlyA⁺toxR⁺ompU⁺tcpI⁺基因型，1株为hlyA⁺toxR⁺mshA⁺基因型；20株病例来源有5株为hlyA⁺toxR⁺mshA⁺基因型，4株为hlyA⁺toxR⁺ompU⁺基因型，3株为hlyA⁺toxR⁺mshA⁺TTSS⁺基因型，3株为hlyA⁺toxR⁺基因型，1株为hlyA⁺toxR⁺ompU⁺mshA⁺TTSS⁺chxA⁺基因型，1株为hlyA⁺toxR⁺mshA⁺TTSS⁺chxA⁺基因型，2株为hlyA⁺toxR⁺ompU⁺mshA⁺TTSS⁺基因型；1株为hlyA⁺toxR⁺ompU⁺tcpI⁺基因型。 2.4 PFGE 分型 (图 1)

对24株非O1/O139群霍乱弧菌进行PFGE分型(Not I酶切)，共分为24个型别，PFGE 带型相似度为75%～97.6%，病例来源菌株与同期海水产品来源菌株经NotⅠ酶切后的带型各不相同，无明显的聚类；不同年份以及不同地区来源的菌株也不形成明显的聚类。

图 1

图 1 2011—2013年非O1/O139群霍乱弧菌PFGE指纹图谱及抗菌药物耐药谱

本研究中24株菌均未检出ctxA、tcpA、ace、zot、st 5种毒力基因，表明这24株菌不具有引起霍乱的典型毒力基础，暂不具备引起烈性传播的可能性，但在今后的日常监测工作中仍应重视霍乱毒素基因的检测，从病例及监测样品中分离到非O1/O139群霍乱菌株仅仅是第一步，如何快速检测到产毒株，并及时进行防范，对霍乱疫情的控制具有重要意义。

根据已有的研究和报道，非O1/O139群霍乱弧菌主要分离自环境，并不引起或仅少数引起散发的腹泻^{[6, 10]}。近年，从腹泻病例分离得到非O1/O139群霍乱弧菌日益增多。目前报道的引起腹泻的非O1/O139群霍乱弧菌中，有些菌株致病因子与01群或者O139群霍乱弧菌相似^[10]，故认为非O1/O139群霍乱弧菌可能通过基因水平转移的方式获得TCP或CT 2种毒力而成为产毒株^[11]，引起腹泻。但大多数病例来源的非O1/O139群霍乱弧菌菌株并不携带TCP、CT等致病因子的基因簇，致病机制难以解释。

本研究结果显示，24株菌株的毒力基因型别多样，在所有菌株中均检测出toxR和hlyA基因，这与国内报道基本一致^[12]；本研究结果显示4 株(16.67%)霍乱弧菌携带tcpI 基因，11株(45.83%)霍乱菌株携带ompU基因，提示其不仅仅有病理学意义，还有更重要的生理学意义^[13]。本研究结果显示9株 (37.5%)霍乱弧菌携带TTSS基因，与 Chatterjee等^[8]的结果一致，有研究报道在1株致腹泻但不产霍乱毒素的非O1/O139群菌株，发现Ⅲ型分泌系统(TTSS)在致肠道黏膜病理改变以及致腹泻方面的重要作用^[14]。与产毒霍乱弧菌导致的腹泻有不同，该菌导致肠黏膜明显的病理损伤，提示不产毒素的霍乱弧菌菌株可能存在其他的致病机制，有待进一步研究。

本研究24株非O1/O139群霍乱弧菌对11种药物进行药敏试验，发现分离自病例的菌株对四环素、萘啶酸、氯霉素和复方新诺明等多种抗生素有一定耐药；分离自海水产品的菌株对四环素、氯霉素和复方新诺明耐药。整体来看，本研究24株菌株对磺胺类，一代喹喏酮类，四环素类等传统抗生素耐药率较高，对临床上目前常用的新一代抗菌药物诺氟沙星、环丙沙星和多西环素等具有较高的敏感率，提示治疗效果较好，但仍应注意合理用药，避免耐药菌株，尤其是多重耐药菌株的产生。

将分离的24株菌进行PFGE图谱聚类分析，显示菌株间差异较大，24株菌分带型均不相同，提示病例及海水产品中的非O1/O139群霍乱弧菌存在明显的遗传多样性。