保健食品中所含成份均以天然物质为主，具有毒性和不良反应小、易于长期服用等特点，而被人们广泛认可。其中增强机体免疫功能的保健食品因具有提高机体细胞免疫、体液免疫等功能成为市场上最为畅销的保健食品。研究表明，社区居民对保健食品风险认知水平具有明显差异^[1]，而消费者对保健食品知识的了解程度是影响保健食品消费的重要因素^[2]。海参营养丰富，蛋白质含量达52.2%，海参多糖等活性物质约占15%，富含海参皂甙(海参素)、维生素和微量元素等，海参作为保健食品具有抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫力、抗疲劳等功效。本研究通过观察小鼠细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫等相关指标，评价海参粉对小鼠免疫功能的改善作用，以期为增强机体免疫功能的保健食品开发提供科学依据，也为消费者对保健食品功效作用的正确认知提供帮助。

海参粉(大连某海洋生物有限公司)，每100 g含粗多糖0.7 g、蛋白质17.5 g。二硝基氟苯(DNFB)(德国MERCK公司)、1 640细胞培养液(美国GIBCO公司)、2-巰基乙醇(中国医药集团上海化学试剂有限公司)、刀豆蛋白A(上海化学试剂公司)、噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(美国Solonlnd公司)、印度墨汁(北京笃信精细制剂厂)、小鼠白血病细胞(mouse lymphoma，YAC-1)(武汉大学细胞保藏中心)、吩嗪二甲酯硫酸盐(中国医药北京化学试剂公司)。722可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)，MK3酶标仪(芬兰Labsystems Dragon公司)。

无特定病原体(SPF)级远交群雄性昆明种小鼠200只，18～22 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。小鼠于屏障系统动物实验室饲养，温度(22±1.5)℃，湿度(50±10)%，工作照度160～280 lx，人工照明12 h黑夜12 h，噪音<60 dB。

200只小鼠适应性饲养1周，随机分为4组，每组50只，对照组(生理盐水)、低、中、高剂量海参粉组(0.33、0.67、1.00 g/kg)，灌胃给予受试物，灌胃容量为0.2 mL/10 g，每天1次，连续30 d，末次给予受试物30 min后，分别取材，检测各免疫指标。

选择进行脾淋巴细胞转化试验小鼠，分别于试验初始时、实验终末时称量小鼠体重，计算体重增重(g)=试验终末体重-试验初始体重；处死小鼠，无菌取脾时，称量脾脏、胸腺重量，计算脾脏、胸腺指数。

各组随机取小鼠10只，腹部脱毛，用DNFB 50 μL涂抹致敏，5 d后再用10 μL DNFB 涂抹小鼠右耳，24 h后处死小鼠，取左右耳，用打孔器取下直径8 mm耳片，称重，左右耳片重量之差即为耳肿胀指数。

各组随机取小鼠10只，无菌取脾，用Hank′s液制成单细胞悬液待用。(1)脾淋巴细胞转化试验：采用MTT法，调整脾细胞浓度为3×10⁶个/mL；将细胞悬液分2孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，其中一孔加75 μL 刀豆蛋白A(7.5 μg/mL)，另一孔作对照，置5%CO₂、37^℃培养72 h，培养结束前4 h每孔吸弃上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清 1 640培养液，同时加入MTT(5 mg/mL)50 μL，继续培养4 h，每孔加入1 mL酸性异丙醇，用分光光度计在570 nm处测光密度(OD值)，用刀豆蛋白A孔OD值减去对照孔OD值代表淋巴细胞增殖能力。(2)NK细胞活性测定：采用乳酸脱氢酶法，取靶细胞(YAC-1，浓度4×10⁶个/mL)和效应细胞(脾细胞，浓度2×10⁷个/mL)各100 μL，加入U型96孔板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5% Triton各100 μL，设3个平行孔，于5%CO₂、37 ℃培养 4 h，1 500 r/min离心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔板中，加入乳酸脱氢酶基质液100 μL，反应3 min，用酶标仪在490 nm处测定光密度(OD值)。

各组随机取小鼠10只，抗体生成试验采用Jerne改良玻片法；血清溶血素试验采用血凝法，具体操作参考文献^[3]进行。

各组随机取小鼠10只，从尾静脉注入印度墨汁，注入墨汁后2、10 min，分别从小鼠内眦静脉丛取血20 μL，立即加入2 mL Na₂CO₃溶液中，以600 nm测定光密度(OD值)；将小鼠处死，取肝脏、脾脏，用滤纸吸干，称重，计算吞噬指数α^[3]。

采用半体内法，每组10只小鼠，每只小鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 mL，30 min后处死小鼠，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动小鼠，吸出腹腔洗液1 mL，分别滴于2张载玻片上，置37 ℃ 30 min，漂洗晾干，用1∶1丙酮甲醇溶液固定，Giemsa染色，显微镜下(1 000×)计数100个巨噬细胞，计算巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率。

实验数据以x±s表示，采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法，P<0.05为差异有统计学意义。

与对照组比较，各海参粉组小鼠体重增重、胸腺指数、脾脏指数、耳肿胀指数均无明显变化(P＞0.05)。

表 1

表 1 海参粉对小鼠体重增重、脏器系数、耳肿胀指数影响(x±s，n=10) 组别(g/kg) 体重增重(g) 胸腺指数 脾脏指数 耳肿胀指数(g) 0.00 18.00±1.18 1.82±0.43 3.62±0.79 0.021±0.009 1.00 22.76±2.15 2.18±0.47 3.60±0.96 0.020±0.005 0.67 24.66±2.84 1.94±0.46 3.38±0.55 0.022±0.006 0.33 24.80±2.51 2.23±0.63 3.63±0.55 0.026±0.006

表 1 海参粉对小鼠体重增重、脏器系数、耳肿胀指数影响(x±s，n=10)

与对照组比较，海参粉中、低剂量组小鼠淋巴细胞转化能力增强(P<0.05)、NK细胞活性明显升高(P<0.01)。结果显示，海参粉具有一定增强小鼠细胞免疫功效作用。

表 2

表 2 海参粉对小鼠淋巴细胞转化与NK细胞活性影响(x±s，n=10) 组别(g/kg) 淋巴细胞转化(OD值) NK细胞活性(%) 0.00 0.275±0.077 44.91±2.55 1.00 0.212±0.109 45.14±5.14 0.67 0.370±0.096a 57.54±7.29b 0.33 0.378±0.125a 57.24±7.31b 注：与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 2 海参粉对小鼠淋巴细胞转化与NK细胞活性影响(x±s，n=10)

与对照组比较，海参粉各组小鼠抗体生成细胞数量(溶血空斑数)与血清溶血素水平(抗体积数)均无明显变化(P＞0.05)。结果表明，海参粉未表现出对小鼠的体液免疫功能具有促进作用。

表 3

表 3 海参粉对小鼠抗体生成细胞与血清溶血素水平影响(x±s，n=10) 组别 (g/kg) 溶血空斑数 (×103个/106脾细胞) 抗体积数 0.00 1.35±0.50 117.80±31.52 1.00 1.84±0.51 130.90±25.65 0.67 1.90±1.32 135.80±25.56 0.33 1.49±0.36 108.00±25.01

表 3 海参粉对小鼠抗体生成细胞与血清溶血素水平影响(x±s，n=10)

与对照组比较，低、高剂量海参粉组小鼠碳廓清试验吞噬指数α明显升高；与对照组比较，各海参粉组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验吞噬百分率无明显变化。结果表明，海参粉具有一定增强单核巨噬细胞功能作用。

表 4

表 4 海参粉对小鼠单核巨噬细胞功能影响(x±s，n=10) 组别(g/kg) 碳廓清吞噬指数α 吞噬鸡红细胞(%) 0.00 5.42±0.58 5.90±2.77 1.00 6.25±1.21a 5.80±3.29 0.67 6.00±0.43 5.20±2.70 0.33 6.18±0.86a 5.80±3.19 注：与对照组比较，a P<0.05。

表 4 海参粉对小鼠单核巨噬细胞功能影响(x±s，n=10)

免疫系统是动物机体的防御系统，可特异性或非特异性地排除侵入机体的异物。动物的免疫系统一般由免疫器官、其他器官内的淋巴组织、免疫细胞免疫分子(构成机体的特异性免疫和非特异性免疫系统)等组成。具有增强机体免疫力的一类保健食品可能针对机体细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫能力等不同侧面，因此，评价功能性食品对机体免疫功能影响的指标较多，方法比较复杂。淋巴细胞转化试验是细胞免疫功能评价的常用体外试验方法，刀豆蛋白A和脂多糖可分别刺激小鼠T、B淋巴细胞增殖，淋巴细胞转化率的高低可反映机体细胞免疫水平^[4]，而T淋巴细胞的功能状态，在很大程度上反映机体的细胞免疫水平；T淋巴细胞合成的许多淋巴因子在机体免疫过程中具有重要作用。血清溶血素试验可以检测体内产生的抗体量，而绵羊红细胞的定量溶血素测定可代表抗体形成细胞数目，二者均可反映机体的体液免疫功能^[5]。本研究结果显示，连续给予海参粉30 d后，与对照组比较，小鼠体重增重及免疫相关器官胸腺指数、脾脏指数均未发生明显变化，表明长期服用海参粉对机体整体营养发育状况未产生明显影响；与对照组比较，各海参粉组小鼠耳肿胀指数虽然未发生明显变化，但低、中剂量海参粉组小鼠淋巴细胞转化能力与NK细胞活性均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示海参粉具有一定增强机体的细胞免疫力作用。

非特异性免疫是机体免疫系统的重要组成部分，单核一巨噬细胞吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一^[6]。单核巨噬细胞系统的激活包括巨噬细胞增殖及功能活跃2个方面，采用碳廓清吞噬指数α与腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率可分别反映巨噬细胞的增殖能力及功能状态。本研究结果表明，与对照组比较，低、高剂量海参粉组小鼠碳廓清试验吞噬指数α明显升高。提示，长期给予海参粉，对小鼠机体特异性免疫力和非特异性免疫力均有一定增强作用。这一结果与已有文献报道基本一致^{[7, 8]}。关于海参粉中何种具体功效成分对小鼠免疫功能具有增强作用以及机制，有待进一步研讨。