间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是目前倍受关注的一类具有自我更新能力和多向分化潜能的组织干细胞，可以从骨髓、肝脏、脂肪等组织获得。MSCs虽然来源于中胚层，但在特定条件下，可分化为各胚层的多种细胞或组织^[1～4]，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经样细胞、内皮细胞等，可作为细胞治疗的种子细胞和基因治疗的载体细胞^{[5, 6, 7, 8]}。近年研究结果表明，MSCs也可以从人脐带或脐血中获得，羟丙基甲基纤维素是常用的药用辅料，一般作为分散剂、增稠剂、眼科植入剂、美容填充辅料等使用^{[9, 10]}，本研究旨在探讨羟丙基甲基纤维素在人脐血MSCs分离中应用的可行性及分离效果，为脐带血干细胞分离提供更加有效方法，为进一步MSCs培养、传代及定向分化提供细胞来源，结果报告如下。

脐带血(采自沈阳市某市级医院健康足月顺产新生儿)，经产妇及家属知情同意，且产妇健康，排除传染性疾病、血液疾病、恶性肿瘤、各种严重妊娠并发症等，脐带血用采血袋密闭式方法采集(采用肝素抗凝剂收集)，每份50～100 mL,采集后6 h内进行实验；羟丙基甲基纤维素(上海昌为医药辅料科技有限公司)，明胶(国药上海医药集团公司)，羟乙基淀粉(辽宁海神联盛制药有限公司)，DMEM /F12培养基 、磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)(美国 Hyclone 公司)；淋巴细胞分离液(Percoll，密度1.077 g/mL，天津灏洋公司)、胎牛血清(美国Gibco公司)；荧光标记小鼠抗人抗体 CD44、CD90、CD105、CD34、CD45(美国BD Pharmingen 公司)。CO₂培养箱(美国 Thermo 公司)，流式细胞仪(美国BD Pharmingen 公司)，离心机(美国 Sigma 公司)，倒置显微镜(重庆光学仪器厂)。

>分别将3种沉降因子配制成高、中、低浓度(羟丙基甲基纤维素0.3%、0.2%、0.1%、明胶0.6%、0.45%、0.3%、羟乙基淀粉8%、6%、4%)，将血样先用生理盐水稀释，再加入上述不同浓度沉降因子，血样、生理盐水和沉降因子的比例是2:1:3，混匀后静置至界面分层清晰时记录时间。根据界面清晰程度判断不同浓度的沉降因子沉降红细胞所需时间(min)。

取上述试管内上清液，以1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入一定体积的PBS混匀，再以1 500 r/min离心5 min，洗涤2次，离心后弃上清，加入一定量的 PBS 使之成细胞悬液后缓慢叠加于相同体积的 Percoll 分离液上，以2 000 r/min离心20 min，吸取中间白色云雾状有核细胞层的细胞，加入一定体积的 PBS 混匀，以1 500 r/min离心5 min，洗涤1次，弃上清后加入PBS混匀成细胞悬液，采用细胞计数板在倒置显微镜下计数不同浓度沉降因子对MSCs回收量。

取0.4%台盼蓝10 μL和计数后的细胞悬液90 μL，染色3~5 min，之后将其滴在细胞计数板上，计数视野内200个细胞中被染色的细胞个数，计算回收MSCs的存活率。

对羟丙基甲基纤维素分离出的MSCs进行培养(含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37 ℃、5%CO₂、饱和湿度)，传至第3、20代及液氮冻存 6 个月后复苏再继续传至 35 代，采用流式细胞仪检测传代后MSCs CD44、CD90、CD105、CD34、CD45表达。如果CD44、CD90、CD105 呈阳性表达，CD34、CD45 呈阴性表达，则表明符合干细胞表面标志特征。

数据采用x±s表示，用SPSS 15.0软件进行统计分析，各指标的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

羟丙基甲基纤维素、明胶和羟乙基淀粉对红细胞均有较好的沉降作用，随沉降因子浓度增加沉降速度加快；与明胶和羟乙基淀粉比较，羟丙基甲基纤维素沉降红细胞所需时间最短，差异均具有统计学意义(t=16.587~24.477，P<0.05)。

表 1

表 1 不同沉降因子沉降红细胞所需时间比较(min，x±s，n=10) 沉降因子 高浓度 中浓度 低浓度 羟丙基甲基纤维素 15.1±1.0 15.4±1.0 25.3±1.5 明胶 28.3±2.3a 30.1±1.7a 40.2±2.0a 羟乙基淀粉 27.1±1.5a 28.1±1.5a 38.0±1.8a 注：与对照组比较，a P＜0.05。

表 1 不同沉降因子沉降红细胞所需时间比较(min，x±s，n=10)

羟丙基甲基纤维素对脐血MSCs回收量最高，3种浓度羟丙基甲基纤维素对脐血MSCs回收量均高于明胶和羟乙基淀粉，差异均具有统计学意义(t=8.677~47.462，P＜0.05)。

表 2

表 2 3种沉降因子回收MSCs量(1×106个/mL，x±s，n=10) 沉降因子 高浓度 中浓度 低浓度 羟丙基甲基纤维素 6.72±0.23 6.24±0.30 6.64±0.23 明胶 2.48±0.20a 2.08±0.15a 2.56±0.15a 羟乙基淀粉 6.88±0.19a 5.12±0.27a 5.52±0.19a 注：与对照组比较，a P＜0.05。

表 2 3种沉降因子回收MSCs量(1×106个/mL，x±s，n=10)

羟丙基甲基纤维素回收MSCs的存活率最高，其次是明胶，羟乙基淀粉最低；3种浓度羟丙基甲基纤维素回收MSCs的存活率均高于明胶和羟乙基淀粉，差异均具有统计学意义(t=2.829~10.200，P＜0.05)。

表 3

表 3 3种沉降因子回收MSCs存活率比较(%，x±s，n=10) 沉降因子 高浓度 中浓度 低浓度 羟丙基甲基纤维素 96.1±1.2 99.7±0.5 98.0±1.3 明胶 94.6±1.2a 96.6±1.5a 95.6±1.7a 羟乙基淀粉 92.6±1.5a 94.6±1.5a 94.8±1.7a 注：与对照组比较，a P＜0.05。

表 3 3种沉降因子回收MSCs存活率比较(%，x±s，n=10)

对羟丙基甲基纤维素分离出的MSCs进行培养、传代，传至第3、20代及液氮冻存6个月后复苏再继续传至35代时，MSCs CD44、CD90、CD105表达均呈阳性，CD34、CD45表达呈阴性，符合干细胞表面标志特征。

从脐带血中分离培养 MSCs 细胞，常用明胶^[11]或羟乙基淀粉^{[12, 13]}。对脐带血 MSCs 分离选用的沉降因子不仅仅要考虑分离效果，还应考虑对细胞的损伤，因为损伤对细胞培养、传代会有一定影响。本研究采用羟丙基甲基纤维素作为沉降因子，探讨其在人脐血 MSCs 分离中应用的可行性及分离效果，结果表明羟丙基甲基纤维素沉降红细胞速度快，MSCs 回收量大，细胞存活率高，明显优于明胶和羟乙基淀粉。本研究结果还显示，羟丙基甲基纤维素分离出的MSCs经培养、传代、纯化至第3、20代及液氮冻存6个月后复苏再继续传至 35 代，用流式细胞仪检测，CD44、CD90、CD105表达均呈阳性，CD34、CD45表达呈阴性，符合间充质干细胞表面标志特征。提示羟丙基甲基纤维素可以用于脐带血MSCs分离，其最适宜浓度为0.2%，效果优于常用的分离试剂明胶和羟乙基淀粉。