阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii E.sakazakii)属肠杆菌科，是一种无芽孢、棒状、周生鞭毛、革兰阴性食源性致病菌^[1]。婴幼儿易被阪崎肠杆菌感染，致死率>80%^[2]。婴儿配方粉中微量的阪崎肠杆菌污染(<3 CFU/100 g)也能导致感染的发生^[3]。阪崎肠杆菌的检测主要采用传统的分离培养方法，步骤繁多，耗时5~8 d^[4]。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)^[3]、红外光谱法^[5]等可用来快速检测阪崎肠杆菌。本文采用免疫富集捕获-PCR(immunocaptured PCR，IC-PCR)法，用特异性抗体富集目标菌在同一PCR管中直接进行扩增，同时提高了特异性和灵敏度，可缩短检测流程，是一种值得在实际检测中推广的快速检测方法。

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii ATCC 29004)，大肠杆菌O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7 ATCC 882346)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 27660)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhiumukriunm ATCC 22956)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis ATCC 13076)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 43251)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica ATCC 23715)、福氏志贺菌(Shigella flexneri ATCC12022)、宋内氏志贺菌(Shigella sonnei ATCC 25931)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae ATCC 51329)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia ATCC 10373)均为上海慧耘生物科技有限公司保藏的标准菌株。

阪崎肠杆菌单克隆抗体(3 mg/mL)、阪崎肠杆菌酶联免疫试剂盒(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)(上海慧耘生物科技有限公司)，普通营养肉汤、万古霉素改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium，MLST)培养基、脑心浸液(Brain Heart Infusion Broth，BH I)等培养基(上海国药集团)，10×PCR Buffer、dNTPs、TapDNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；rfbF基因引物由上海生工生物公司合成。

阪崎肠杆菌标准菌株和对照菌株分别在普通营养肉汤(副溶血性弧菌培养基需加入3% NaCl，肺炎链球菌培养基需加入7%全血)中37 ℃过夜培养。

用包被液稀释阪崎肠杆菌单克隆抗体(3 mg/mL)，使得单抗浓度为10 μg/mL，将稀释好的单克隆抗体每管50 μL加入PCR管中，4 ℃过夜包被。将PCR管中液体扣出，再加入磷酸盐缓冲液吐温-20(phosphate buffered saline with Tween-20，PBST)0.1 mmol/L，pH 7.4洗涤，洗涤时轻微震荡，重复洗涤2~3次，叩干管内残存洗涤液。免疫PCR管中加入过夜培养的大肠杆菌O157∶H7，37 ℃孵育2 h，用PBST洗涤，重复洗涤2~3次，叩干管内残存洗涤液。

PCR扩增阪崎肠杆菌的16SrRNA基因。在PCR管中加入PCR体系：10×PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mmol/L)4 μL；TaqDNA聚合酶(5 U/L)1 μL；正向引物(10 μmol/L)2 μL，引物5′-GGG TTG TCT GCG AAA GCG AA-3′；反向引物(10 μmol/L)2 μL，引物5′-GTC TTC GTG CTG CGA GTT TG-3′；加入ddH₂O双蒸水补足至50 μL(反应体系为50 μL)。PCR的反应程序参数为：94 ℃ 预变性5 min；35个循环(94 ℃变性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s)，72 ℃ 5 min，4 ℃保温；扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带并且紫外投射成像分析。

将目的菌株阪崎肠杆菌和对照菌株金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、福氏志贺菌、宋内氏志贺菌、痢疾志贺菌、肺炎链球菌、大肠杆菌O157∶H7培养过夜，然后在IC-PCR管中加入各种培养过夜菌株的菌液，进行免疫捕获和PCR扩增检测。

将培养过夜阪崎肠杆菌平板计数，用生理盐水将其稀释至3.2×10⁸~3.2×10² CFU/mL，各取200 μL菌液加入制备好的IC-PCR管中，进行免疫捕获和PCR扩增检测，同时设置阴性对照，每个梯度的菌液直接PCR扩增进行灵敏度对比实验。

食品为牛奶、酸奶、香肠、果汁、蛋糕，按照国标GB/T 4789.40-2008《食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》，取食品100 g(mL)加入到900 mL MLST 培养基中，在拍击式均质器上均质2~3 min，对匀浆液加入不同浓度阪崎肠杆菌纯菌液，菌液浓度依次为：3.2×10²~3.2×10⁷ CFU/mL，然后分别进行免疫捕获和PCR扩增检测，设置空白对照，同时进行每个梯度污染食品的直接PCR对比实验。

在奶粉、牛奶中加入稀释好的阪崎肠杆菌，菌浓度为3.2×10～3.2×10⁴ CFU/mL，每个梯度分别(44±0.5)℃培养，每隔0、2、4、6、16、22 h取样，样品分别进行IC-PCR检测和直接PCR检测。用ELISA试剂盒进行模拟增菌时间对比实验。样品前处理后加样、温育、洗涤、加酶标抗体；显色，终止；用酶标仪于450 nm波长下测量各孔的吸光值(A)值。

图 1

注：282 bp为目标条带16SrRNA基因；M：1000 bp DNA ladder；N：阴性对照；1、2：阪崎肠杆菌； 3：小肠结肠炎耶尔森菌；4：大肠杆菌O157：H7；5：肠炎沙门菌；6：鼠伤寒沙门菌；7：单增李斯特菌； 8：痢疾志贺菌；9：宋内氏志贺菌；10：福氏志贺菌；11：金黄色葡萄球菌；12：肺炎链球菌。 图 1 阪崎肠杆菌IC-PCR法特异性

图 1显示，只有泳道1和2阪崎肠杆菌扩增出282 bp产物，其他对照菌株均无扩增产物，提示IC-PCR方法对阪崎肠杆菌有较好的特异性。 2.2 IC-PCR法灵敏度验证(图 2)

图 2

注：282 bp为目标条带16SrRNA基因；M：1 000 bp DNA ladder；N：阴性对照；1~7：细菌浓度依次为：3.2×102~3.2×108 CFU/mL。 图 2 阪崎肠杆菌IC-PCR法灵敏度

结果显示，直接PCR检测阪崎肠杆菌模拟带菌食品(牛奶、酸奶、蛋糕、果汁、香肠)样本的灵敏度可达到10⁵~10⁷ CFU/mL。IC-PCR检测阪崎肠杆菌模拟带菌食品的灵敏度可达到10³ CFU/mL，IC-PCR比直接PCR检测灵敏度提高了10²~10⁴倍。

结果显示，直接PCR方法和ELISA试剂盒方法检测低浓度(初始菌浓度10~10² CFU/mL)时需要增菌16 h才能检测到目标菌。而IC-PCR只需增菌4~6 h就可检出目标菌。牛奶样品中初始菌浓度达10⁴ CFU/mL时，不需前增菌IC-PCR就可以检测出目标菌。

表 1

表 1 3种检测方法增菌时间比较(h) 菌液浓度 (CFU/mL) 牛奶 奶粉 直接PCR IC-PCR ELISA 直接PCR IC-PCR ELISA 10 16 6 16 >24 6 16 102 16 4 16 >24 6 16 103 4 4 16 >24 4 6 104 2 0 6 >24 2 6

表 1 3种检测方法增菌时间比较(h)

阪崎肠杆菌是存在自然环境中的一种条件致病菌，但其污染源尚未完全确定。该菌可感染任何年龄人群，尤其对于早产儿、病弱婴儿、免疫受损婴儿具有较强侵染力，感染此致病菌的婴幼儿可导致败血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎，婴儿死亡率高达50%。

现行的阪崎肠杆菌检测方法是基于分离培养建立的常规生化方法，操作复杂流程长，且对技术人员、检测条件要求较高，无法实现奶粉生产的全过程监管，近年来阪崎肠杆菌的快速检测方法研究取得了长足进步，如酶联免疫法、PCR法等，但这些方法均存在检测成本过高、灵敏度偏低、操作复杂等问题。本研究将免疫学和分子生物学方法有机结合起来，免疫学富集可有效的将样品中的病原菌富集，PCR检测可在分子水平进行确认，且所有实验全部在同一PCR管中进行，利用高温裂解细菌释放DNA作为模版，避免了DNA提取过程中的病菌损失，不仅减少了PCR步骤，而且病原菌经过免疫学、分子生物学双重检测后，提高了检测准确性。本研究结果表明，该方法对阪崎肠杆菌纯菌液检测灵敏度可达到10²~10³ CFU/mL，模拟带菌食品检测灵敏度可达到10³ CFU /mL，而且实际检测中只需增菌6 h就可检出目标菌，而直接PCR、ELISA方法则需要增菌16 h。提示IC-PCR是一种高效、灵敏、快速的检测技术，适用于食品安全监管部门、食品企业实施乳制品等样品中阪崎肠杆菌的快速检测。