美洲大蠊属于昆虫纲蜚蠊目蜚蠊亚目蜚蠊科大蠊属，是蜚蠊科中体积最大，也是世界上生命力最强的昆虫类群之一，俗称蟑螂。美洲大蠊是传统中药材，其性寒味咸，有辛辣味，有散瘀、消积、解毒、利水、消肿等功能。近年来的研究表明，蟑螂油对S-180及异种移植人食管癌小鼠有显著抗癌作用，美洲大蠊的生物制剂—康复新在体外能诱导多种肿瘤细胞系发生细胞凋亡^[1]。近年来对美洲大蠊药理作用的研究越来越多,但美洲大蠊提取物对肺癌细胞影响的研究较少。本研究观察美洲大蠊提取物在体外对肺癌细胞凋亡影响，并对其作用机制进行初步探讨。结果报告如下。

肺癌细胞H125(辽宁医学院科学实验中心)；美洲大蠊提取物(四川好医生攀西药业)；胰蛋白酶(上海慧颖生物科技有限公司)；小牛血清(杭州四季清生物制品公司)；达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM)(上海慧颖生物科技有限公司)；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、细胞周期检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；annexin V-FITC凋亡试剂盒(北京宝赛生物公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，碘化丙啶(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)。流式细胞仪(美国BD公司)，凝胶成像仪(美国BIORAD公司)，二氧化碳培养箱(美国杜邦公司)，IBO X600活体成像系统(广州中科恺盛医疗科技有限公司)，XD-101型倒置显微镜 (日本OLYMPUS公司)。

采用MTT法，H125细胞在37 ℃,5%CO₂环境中培养，调整对数生长期细胞浓度为1×10⁴个/100 μL接种于96孔板，继续培养，待细胞贴壁达到90%，将细胞分为空白对照组(不加细胞)，阴性对照组(仅加入细胞)，阳性对照组(顺铂10 μg/mL^{[2, 3]})和美洲大蠊组(美洲大蠊提取物5、10、20、40、80 μg/mL)，各组设5个平行孔。培养24 h后，每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h，避光加入DMSO 150 μL，震荡使结晶充分溶解。酶标仪490 nm处测定吸光度(A)值。抑制率(%)=(1－实验组A值/空白对照组A值)×100%。计算平均抑制率。

取对数生长期H125细胞，设阴性对照组，阳性对照组(顺铂10 μg/mL)和美洲大蠊组(10、20、40 μg/mL)。培养24 h后，0.25%胰酶消化，收集细胞(800 r/min离心5 min)。按照试剂盒说明操作，70%乙醇4 ℃固定过夜，800 r/min离心5 min，沉淀细胞，磷酸盐缓冲液洗细胞(800 r/min,5 min)2次，碘化丙啶染色。冰浴避光存放，1 h内用流式细胞仪检测。

细胞分组与处理同1.2.2，按照试剂盒说明操作，采用Annexin V-FITC/PI双染，避光染色15 min，1 h内用流式细胞仪分析检测。

细胞分组与处理同1.2.2，按照试剂盒说明操作。加入JC-1染色工作液体，细胞培养箱中孵育20 min。600 g 4 ℃离心4 min，沉淀细胞，弃上清。用JC-1染色缓冲液洗涤2次，最后用JC-1染色缓冲液重悬，流式细胞仪进行分析。以绿色荧光细胞的百分率表示线粒体膜电位变化，绿色荧光细胞的百分率升高表明线粒体膜电位下降。

采用蛋白免疫印迹法，细胞分组与处理同1.2.2，4 ℃下加入裂解液，裂解30 min。10%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，半干法将蛋白转印至聚偏氟乙烯膜上，加入1∶1 000稀释一抗，4 ℃孵育过夜。再加入1∶1 000稀释二抗，孵育1 h后显色、照相并分析。

数据用x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行分析。单因素方差分析组间差异，最小显著差法进行组间两两比较,以P＜0.05为差异有统计学意义。

阳性对照组、美洲大蠊5、10、20、40、80 μg/mL组H125细胞抑制率分别为74.7%、19.6%、31.2%、47.2%、70.3%、82.4%，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，5~80 μg/mL美洲大蠊提取物均不同程度抑制人肺癌细胞H125的生长，IC₅₀值为24.8 μg/mL。

美洲大蠊提取物可减少人肺癌H125细胞G2/M期细胞比例，增加S期细胞比例，将细胞周期阻滞于S期。并呈浓度依赖性。

表 1

表 1 美洲大蠊对人肺癌细胞H125细胞周期影响(x±s，n=5) 组别(μg/mL) G0/G1 S G2/M 阴性对照组 50.21±0.085 6.28±0.059 49.16±0.082 顺铂组               10 46.79±0.126 21.74±0.104b 22.47±0.172a 美洲大蠊组       10 45.85±0.097 9.43±0.152 47.25±0.114                          20 46.17±0.159 16.15±0.131b 31.46±0.057                          40 46.98±0.104 20.92±0.096b 23.12±0.159a 注：与阴性对照组比较，a P＜0.05，b P＜0.01。

表 1 美洲大蠊对人肺癌细胞H125细胞周期影响(x±s，n=5)

与阴性对照组比较，美洲大蠊呈剂量依赖性地增加人肺癌H125细胞凋亡率，差异有统计学意义(P＜0.05)；美洲大蠊提取物可明显降低人肺癌H125细胞的线粒体膜电位，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表 2

表 2 美洲大蠊提取物对H125细胞凋亡影响(%，x±s，n=5) 组别(μg/mL) 凋亡率 绿色荧光细胞百分率 阴性对照组 0.97±0.152 0.07±0.12 阳性对照组 25.39±0.206a 36.02±0.09a 美洲大蠊组10 9.45±0.182a 14.96±0.17a            20 15.38±0.197a 23.81±0.15a            40 24.76±0.168a 34.12±0.21a 注：与阴性对照组比较，a P＜0.01。

表 2 美洲大蠊提取物对H125细胞凋亡影响(%，x±s，n=5)

美洲大蠊提取物处理人肺癌H125细胞24 h后，与阴性对照组比较，Bax蛋白表达增强，Bcl-2蛋白表达减弱。

Figure 1">图 1

注：1：阴性对照组，2~4：美洲大蠊10、20、40 μg/mL组，5：阳性对照组。 Figure 1">图 1 美洲大蠊提取物对H125细胞Bax、Bcl-2蛋白表达影响

肺癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，在一些大城市和中等城市，肺癌已占恶性肿瘤发病率的首位。中药诱导肺癌细胞凋亡是一个新兴课题，其作用已被广大学者认同，研究中药诱导肺癌细胞凋亡具有重要的理论和现实意义^{[4, 5]}。本研究结果表明，美洲大蠊提取物可明显促进人肺癌H125细胞凋亡，并具有剂量-效应关系。细胞凋亡分外源性和内源性途径，内源性凋亡途径由线粒体介导，当细胞受到凋亡刺激后，线粒体膜通透性发生改变，膜电位下降，导致促凋亡蛋白释放，最终引起细胞凋亡^[6]。本研究应用JC-1荧光探针技术进行细胞线粒体膜电位检测，结果显示，美洲大蠊可使H125细胞线粒体膜电位下降，并呈浓度依赖性。提示美洲大蠊提取物可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

在细胞凋亡过程中，有2类基因发挥着重要作用，一类是抗细胞凋亡基因，如Bcl-2；另一类是促细胞凋亡基因，如Bax。Bcl-2能够增强线粒体膜电位，抑制线粒体钙离子释放，从而抑制细胞凋亡^{[7, 8]}。本研究结果显示，美洲大蠊提取物使H125细胞Bax蛋白表达增强，Bcl-2蛋白表达减弱。提示美洲大蠊提取物可能通过调节Bax、Bcl-2表达，促进人肺癌H125细胞凋亡。细胞周期的长短反映了细胞所处的状态，一个完整的细胞周期由G0、G1、S、G2和M期组成^{[9, 10]}。本研究结果显示，美洲大蠊提取物在诱导人肺癌H125细胞凋亡的同时可以将细胞周期阻滞于S期，进而影响细胞的生长发育。

综上所述，美洲大蠊提取物可以通过线粒体途径诱导人肺癌H125细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，但其具体作用机制尚不清楚，如美洲大蠊提取物发挥抗肺癌作用的分子靶点与信号通路，对凋亡效应分子基因表达的影响等等，值得进一步深入研究。