流感是一种由流感病毒引起的传染病，发病率高、破坏性强，全球每年有25~50万死于流感^[1]。目前流感的预防均选择灭活疫苗，但其不能够有效应对流感病毒变异的速度，开发新型疫苗显的尤为重要。多表位核酸疫苗是将抗原基因内部抗原的活性部位与表达质粒通过串联插入而构建，能够有效发挥疫苗内部抗原表位的优势，去除保护性免疫中不利因素(潜在片段中毒性成分结构)，同时能够对流感病毒中抗原表位的各种型别进行优化组合，为多价疫苗的研发提供基础模型^{[2 --------- 3]}。为探讨前期合成的流感亚型H3579抗A型多表位DNA疫苗的免疫原性，本研究将BALB/c小鼠作为哺乳动物模型，通过检测细胞免疫和体液免疫指标，对流感亚型H3579抗A型多表位DNA疫苗的免疫原性进行评估，为新型通用的流感疫苗的研发奠定基础。现将结果报告如下。

大肠杆菌JM109、pVAX1质粒、H5HA-Epi-H7HA-pUCMT和BHK细胞(辽东学院医学院病原生物试验室)。

脂质体转染试剂(2000 Regengt-Lipofectamine^TM，美国Ivitrogen公司)，Ligase T4DNA、CIAP(上海英杰生命科技公司)，阳性血清(H5、H7、H9，北京康农兴牧科技公司)，抗鸡 IGY 标记 FTTC 二抗〔普洛麦格(北京)生物技术有限公司〕，甲基噻唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT),二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(北京经科宏达生物技术公司)，PE抗鼠标记CD8a、PE抗鼠标记CD4、FTTC抗鼠标记CD3e、HRP羊抗鼠标记IgG(杭州百通生物公司)，ELISA试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)。

BALB/c小鼠100只，6～8 w龄，雌雄各半，体重25～32 g，由大连医科大学动物实验研究中心提供，生产批号为96021-C。将小鼠随机分为10组，每组10只，其中8组为免疫组，2组为对照组：空载体对照组。

采用设计合成的包含H9/H3的H5N1 NA和HA中和表位，以及NP、M基因中含CTL表位的保守序列Epi多表位基因盒，选择载体pVAX，对Epi、H7HA、H5HA融合表达。对候选核酸疫苗组及空载体对照组小鼠在0、21、35 d实施3次免疫，第1次应用rDNA 200 μg于小鼠双侧的胫前肌进行肌注，后2次均采用rDNA 100 μg免疫。于3次免疫后的第10 d收集小鼠眼动脉血，5 000 r/min离心10 min，取上清液，4 ℃保存。取血后将小鼠颈椎脱臼法处死，取小鼠脾脏制备小鼠的脾细胞悬液，进行亚类T细胞的数量统计，IFNγ ELISPOT检测及淋巴细胞的转化试验。

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，定量资料采用±s表示，3组及以上之间的比较采用方差分析，两两比较采用 least significant difference(LSD)检验，P＜0.01差异有统计学意义。

2.1 T淋巴细胞H3、H7亚类数量分析(表 1)

通过对脾T细胞亚类数量检测，并与pVAX1空载质粒组比较，pVAX-H3和pVAX-H7免疫组，CD3⁺CD4⁺与CD3⁺CD8⁺值均升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表 1

表 1 T淋巴细胞H3、H7亚类数量分析(x±s) 组别 CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%) CD4+/CD8+ pVAX1 18.48±1.96 12.34±1.84 1.50 pVAX-H3 26.37±3.41a 15.68±1.95a 1.68 pVAX-H7 26.27±2.62a 14.86±2.28a 1.77 注：经LSD检验，与pVAX1比较，a P<0.01。

表 1 T淋巴细胞H3、H7亚类数量分析(x±s)

与pVAX1空载质粒组比较，pVAX-H5和pVAX-H9免疫组，CD3⁺CD4⁺与CD3⁺CD8⁺值均升高，差异有统计学意义(P<0.01)，且pVAX-H9免疫组CD3+CD4+高于pVAX-H5免疫组。

表 2

表 2 T淋巴细胞H5、H9亚类数量分析(x±s) 组别 CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%) CD4+/CD8+ pVAX1 18.48±1.96 12.34±1.84 1.50 pVAX-H5 24.69±1.75a 16.68±2.62a 0.88 pVAX-H9 31.27±1.93ab 17.58±3.91a 1.78 注：经LSD检验，与pVAX1比较，a P<0.01；与pVAX-H5比较，b P<0.01。

表 2 T淋巴细胞H5、H9亚类数量分析(x±s)

目前DNA疫苗已经受到人们广泛的关注，其既拥有亚单位重组疫苗的安全性，还有减毒活疫苗对免疫应答全方位诱导的功能^[4]。流感病毒的膜蛋白中含有的HA，成为DNA流感疫苗研究环节最重要的靶标^[5]。据文献报道，在动物实验中，免疫HA的实验动物均获得完整的免疫应答^[6]。但以往对核酸疫苗研究时，仅针对单一类型的亚型流感病毒展开，然而这不能适应目前流感变异加速的趋势^[7]。DNA疫苗以及其重组活载体的疫苗中，通过添加M蛋白组分以及NP蛋白组分，发挥各种流感亚型疫苗辅助功能，形成交叉的免疫保护作用^[8]。对抗原表位的研究方法，已经用于临床各种疫苗，包括寄生虫病、流感、肿瘤、艾滋病、乙肝等^[9]。

本研究结果表明，DNA的多表位疫苗可以发挥巨大的优势，HA抗原、NP抗原及M抗原表位不仅具有Th功能，而且可发挥中和作用，同时还能够辅助CTL功能^[10]。本研究前期设计并合成包括H9与H3的H5N1 NA和HA中和表位，以及NP、M基因中，含CTL表位的保守序列Epi多表位基因盒，连接H7HA、H5HA完整基因，从而使H3579复合多表位亚型流感DNA疫苗得以构建。用小鼠进行免疫实验结果显示，亚型H3579抗A型多表位核酸流感疫苗H5HA-Epi-H7HA-1-pVAX能够于BHK正确表达，并且在H9hH3、H7、H5等流感亚型在小鼠中均可获得细胞免疫。由此可见，HA结合抗原表位完整DNA疫苗，具有应对目前出现的亚型流感的潜力，而小鼠的免疫功能强弱，需进一步的攻毒实验予以充分验证。