阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)已成为神经退行性改变继而引发痴呆的主要原因。AD主要损害学习记忆能力，病理特征表现在中枢神经系统老年斑、神经元纤维缠结的出现，临床症状包括进行性智力减退。AD发病率随着年龄的增长急剧升高，西方发达国家85岁以上老人发病率达24%~33%^[1]。伴随着中国老龄化社会进程加快，AD在未来20年内将成为重要的公共健康问题^[2]。本研究以快速老化小鼠(SAMP8)为模型动物，给予茶多酚中重要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)，观察小鼠海马组织中淀粉蛋白前体β位分解酶1(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE1)的表达，以及微管相关蛋白(Tau蛋白)磷酸化水平影响的变化，探讨EGCG对老年痴呆小鼠的神经保护作用及机制。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

Morris水迷宫装置 (安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)，7500定量PCR仪(美国ABI公司)，电泳、转膜设备(美国BioRad公司)，凝胶显影系统(上海天能公司产品)。EGCG(美国Sigma公司、纯度>95%)，兔抗小鼠多克隆BACE1抗体、兔抗小鼠Tau S202、S396磷酸化单克隆抗体(英国Abcam公司)；逆转录PCR引物序列由上海生物工程有限公司合成。 1.2 实验动物分组与处理

SAMP8小鼠40只、SAMR1小鼠(非老化)20只，小鼠均为雄性，2月龄(天津中医学院第一附属医院实验动物中心)，合格证号：SCXK(津)2008-0001。实验设3组，每组20只，分别为模型组(自2月龄普通饲养至8月龄的SAMP8小鼠)、EGCG组(SAMP8小鼠自2月龄起，饮水中加入EGCG，每天2 mg/kg，连续6个月)、对照组(自2月龄普通饲养至8月龄SAMR1小鼠)。饲养结束后，先进行Morris水迷宫测定，然后脱臼法处死小鼠，迅速分离脑组织，生理盐水清洗，分离海马和皮层组织，至1.5 mL 离心管内，液氮30 min，-80 ℃保存。 1.3 指标与方法 1.3.1 EGCG对小鼠学习记忆能力影响

采用Morris水迷宫测定，训练阶段持续2 d，每天2次，训练后开始记录逃避潜伏期，目的象限停留时间，测定共进行5 d。 1.3.2 小鼠海马组织BACE1 mRNA水平检测

采用Trizol法提取总RNA，经紫外分光光度仪检测RNA质量后经RT-PCR反应，测定海马组织中BACE1基因mRNA水平。采用比较Ct值的相对定量法，以三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为参照，应用2-ΔΔCt进行相对定量。BACE1引物序列：上游5′-TCGCTGTCTCACAGTCATCC-3′，下游5′-AACAAACGGACCTTCCACTG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。定量PCR反应体系(25 μL)：SYBR premix(2×)12.5 μL，目的基因上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH₂O 9.5 μL，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。 1.3.3 小鼠海马组织蛋白水平检测

小鼠海马组织，加入预冷的裂解缓冲液，冰上匀浆，离心取上清，考马斯亮蓝测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，封闭，一抗及二抗孵育，BACE1应用兔抗小鼠多克隆抗体，Tau磷酸化位点S202、S396应用兔抗小鼠磷酸化单克隆抗体，经洗膜，ECL发光，照相。 1.4 统计分析

计量资料采用x±s表示，计数资料用百分比表示，应用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 EGCG对小鼠学习记忆能力影响(表 1)

随着学习时间增加，各组小鼠逃避潜伏期均呈缩短趋势；与SAMR1组比较，第5天模型组小鼠平均逃避潜伏期明显延长，目标象限停留时间明显缩短(P<0.01)；与模型组比较，EGCG组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短，目标象限停留时间明显延长(P<0.01)。

表 1

表 1 EGCG对小鼠学习记忆能力影响(s，x±s，n=20) 组别 检测时间 目标象限 停留时间 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 SAMR1组 57.34±3.67 53±3.91 46±3.15 43±2.96 38±2.57 28.79±5.92 模型组 58.03±4.21 56±3.78 55±3.12 52±3.46a 49±2.98a 13.52±3.11a EGCG组 55.25±4.01 54±3.65 49±3.40 45±3.27b 41±3.03b 25.47±4.78b 注：与SAMR1组比较，a P<0.01；与模型组比较，b P<0.01。

表 1 EGCG对小鼠学习记忆能力影响(s，x±s，n=20)

SAMR1、模型组、EGCG组BACE1 mRNA相对表达量分别为(1.434±0.646)、(2.835±0.902)、(1.574±0.556)，与SAMR1组比较，模型组小鼠BACE1 mRNA相对表达量升高；与模型组比较，EGCG组小鼠BACE1 mRNA相对表达量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与SAMR1组比较，模型组小鼠海马区BACE1蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，EGCG组小鼠海马区BACE1蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。

图 1

注：1：SAMR1组；2：模型组；3：EGCG组。 图 1 EGCG对小鼠BACE1蛋白表达影响

2.3 EGCG对小鼠海马组织中Tau蛋白磷酸化水平影响(图 2)

与SAMR1组比较，模型组小鼠海马区Tau蛋白S202、S396位点磷酸化水平较明显升高(P<0.05)；与模型组比较，EGCG组小鼠海马区Tau蛋白S202、S396位点磷酸化水平明显下降(P<0.05)。

图 2

注：1：SAMR1组；2：模型组；3：EGCG组。 图 2 EGCG对小鼠海马区TAU蛋白 Ser202及Ser396位点磷酸化水平影响

EGCG是茶多酚的主要生物活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤以及改善心血管功能等生物活性。目前越来越多的研究发现EGCG的神经保护作用^[3]，Jia 等^[4]发现EGCG可通过抑制肿瘤坏死因子α/JUK激酶信号途径并修复胰岛素受体底物1信号途径减轻淀粉样蛋白前提蛋白/早老素(APP/PS1)小鼠空间记忆能力障碍。Dragicevic等^[5]研究发现，EGCG能显著改善APP/PS1小鼠的氧化损伤和线粒体功能障碍。EGCG能激活细胞的抗氧化防御体系，减少由Aβ引起的细胞损伤及凋亡^[6]。本研究应用SAMP8小鼠模型^{[7, 8]}，探讨EGCG对小鼠海马组织Aβ形成过程中的关键酶^{[9, 10]}BACE1表达影响，结果显示，连续干预6个月后，EGCG组SAMP8小鼠学习和记忆能力明显提高，小鼠脑海马组织中BACE1 mRNA和蛋白水平明显降低。

Tau蛋白的磷酸化在阿尔茨海默病发生发展中起到的重要作用已引起研究者广泛关注^[11]，很多学者认为Tau蛋白磷酸化是AD发病的关键，是治疗的重要靶点。本研究结果显示，模型组SAMP8小鼠海马组织中Tau蛋白S202、S396位点磷酸化水平明显高于SAMR1组(对照)，EGCG干预6个月后，SAMP8小鼠海马组织中Tau蛋白S202、S396位点磷酸化水平均下降，接近SAMR1组小鼠水平。提示EGCG具有一定的改善学习记忆能力作用(神经保护功能)，其机制可能与EGCG调控小鼠脑BACE1基因表达以及调节Tau蛋白磷酸化水平有关。