胡桃醌(juglone，nuein)又名5-羟基-1,4-奈醌、5-羟基-1,4-奈二酮，是从胡桃揪新鲜根皮、枝皮、青果皮中分离出来的羟基奈醌类化合物，是胡桃揪中主要毒性物质^[1]。胡桃醌为黄色针状结晶，熔点为155 ℃,微溶于热水,易溶于氯仿和苯，溶于乙醇和乙醚，溶于碱性水溶液呈紫红色,有升华性。胡桃醌对于S180实体瘤、小鼠腹水型肝癌和自发性胃癌有明显的抗癌活性^[2]。Varga等^[3]研究发现：胡桃醌可以封闭人外周血淋巴细胞的钾离子通道，而钾离子通道保持活性被认为是细胞生长和T细胞增殖的先决条件，胡桃醌的这一作用可能是胡桃醌诱导细胞凋亡的重要方式。此外，胡桃醌可通过直接修饰巯基基团使RNA转录起始前复合物断裂，抑制细胞mRNA合成，直接阻断转录^[4]。对醌类化合物进行抑制细胞生长实验时发现，细胞生长在S期被抑制，酚羟基的个数决定了细胞毒性^[5]。宫颈癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一^[6]。研究表明，宫颈癌已成为严重威胁妇女健康的主要疾病之一^[7]。目前化疗作为其最常用的治疗手段，存在有效率低、副作用大等问题。前期研究发现不同浓度胡桃醌可抑制宫颈癌Hela细胞(含HPV18DNA)的增殖并可促进其凋亡，本研究旨在探讨胡桃醌对另外一种宫颈鳞癌Caski(含HPV16DNA)细胞增殖的影响，从而为胡桃醌的抗宫颈癌作用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

人宫颈鳞癌Caski细胞系(吉林医药学院科学实验室保存)，细胞置于洛斯维公园纪念所(RPMI)1640完全培养基中，在37 ℃、5%CO₂，95%湿度培养箱中培养，细胞单层贴壁生长，每2 d更换1次培养基，细胞每周按1∶3传代。胡桃醌、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)(美国Sigma公司)。BD FAC ScantoTM流式细胞仪(美国BD公司)，Olympus 倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)。 1.2 分组及处理

取对数生长期的Caski细胞，培养24 h 后，去上清，以5×10⁵个/孔接种于96孔板内，每个浓度设4个复孔；24 h后将细胞分成对照组及不同浓度胡桃醌组(20、40、60、80、100 μmol/L)共6组，用RPMI 1640培养基稀释液分别培养24 h用于细胞学形态观察及MTT检测。另取对数生长期Caski细胞，培养24 h 后，去上清，以5×10⁵个/孔接种于96孔板内，孵育24 h后将细胞分成对照组及40 μmol/L胡桃醌组，用RPMI 1640培养基稀释液分别培养12 h用于Hoechest33258 荧光染色及流式细胞仪检测。 1.3 指标与方法 1.3.1 细胞形态学观察

细胞培养24 h后，于倒置显微镜观察不同浓度胡桃醌对Caski细胞影响，评估细胞生长速度、细胞形态和悬浮细胞比例。 1.3.2 细胞增殖检测

采用MTT法，细胞培养24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃继续孵育4 h，取出弃去上清，每孔加入150 μL DMSO振荡10 min，于570 nm测定OD值。 1.3.3 Hoechest33258 荧光染色

细胞培养12 h后，吸出孔内培养液，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)冲洗2 次，每次2 min;加入多聚甲醛固定15 min，吸出固定液，用PBS 洗2 次，每次2～3 min;每孔加入1 mL Hoechst33258 工作液，避光染色5 min，荧光显微镜下检测细胞核形态，随机观察5个视野。 1.3.4 细胞凋亡率检测

采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI 双染法，细胞培养12 h后，消化收集细胞，1 000 r/min 离心10 min，PBS洗涤1次，以100 μL PBS 悬浮细胞，每管加入10 μL annexin V-FITC 和10 μL PI，避光染色10 min，加入380 μL binding buffer，流式细胞仪检测凋亡率。 1.4 统计分析

所有数据以x±s表示，采用SPSS 13.0 统计软件进行统计分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 胡桃醌对Caski细胞形态学影响(图 1)

对照组Caski细胞紧贴瓶底，细胞密集，细胞间连接紧密，呈有规则多边形，细胞触角较短，圆形细胞少。与对照组比较，20 μmol/L胡桃醌组细胞形态无明显变化，40 μmol/L胡桃醌组细胞较为稀疏，附壁疏松，脱壁，60、80、100 μmol/L组细胞变圆，随浓度增加变化更明显。

图 1

注：A：对照组；B、C、D、E、F：20、40、60、80、100 μmol/L胡桃醌组 图 1 不同浓度胡桃醌对Caski细胞形态学影响(×400)

对照组、20、40、60、80、100 μmol/L胡桃醌组Caski细胞增殖率(OD值)分别为(0.99±0.17)、(0.85±0.08)、(0.65±0.11)、(0.53±0.14)、(0.40±0.11)、(0.31±0.05)；不同浓度胡桃醌处理后，Caski细胞生长均受到不同程度抑制，随着胡桃醌浓度增加，细胞增殖抑制亦加强(P<0.05)；胡桃醌对Caski细胞的生长抑制作用呈和剂量依赖关系，IC₅₀值为46 μmol/L。 2.3 胡桃醌对Caski细胞核形态影响(图 2)

荧光显微镜观察显示，对照组Caski细胞大小均一，成弥散均匀的淡蓝色弱荧光；经40 μmol/L胡桃醌处理12 h后，Caski细胞核明显皱缩，并可见致密强荧光，存在核碎裂和凋亡小体等强荧光团块。

图 2

注：A：对照组；B：40 μmol/L胡桃醌组 图 2 胡桃醌对Caski细胞核形态影响(Hoechest33258 荧光染色)

对照组Caski细胞早期凋亡率为(2.86±0.47)%，40 μmol/L胡桃醌处理细胞12 h后，Caski细胞早期凋亡率增加至(15.47±2.56)%；与对照组比较，40 μmol/L胡桃醌组Caski细胞早期凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。 3 讨 论

胡桃醌是一种天然环状醌类，可从胡桃楸的叶及外壳中提取，其抗肿瘤作用在国内外均有报道。肽基脯氨酰顺反异构酶(Pin1)是癌细胞中普遍存在的高表达基因之一，在肿瘤细胞中与细胞分化和增殖有关，在肿瘤细胞中过表达，而在正常组织中则低表达，去除它则肿瘤细胞增殖减低，凋亡增加^[5]。胡桃醌能与Pin1催化域发生不可逆结合，抑制Pin1的活性，从而发挥抗肿瘤活性^[8]。本研究结果显示，40、60、80、100 μmol/L胡桃醌均能使Caski细胞形态发生变化，并可明显抑制Caski细胞生长，IC₅₀为46 μmol/L。

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡^[9]。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一个被动过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程^[10]。根据IC₅₀值，本研究选取与其接近的40 μmol/L胡桃醌做进一步的Caski细胞凋亡实验，结果显示，40 μmol/L胡桃醌可使Caski细胞核形态发生改变，可促进Caski细胞的早期凋亡。胡桃醌促进Caski细胞凋亡机制则有待进一步研究。