肝癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来肝癌发病率和死亡率均呈上升趋势^[1-2]。肿瘤发生、发展与抑癌基因启动子甲基化引起的基因失活有着密切的联系，涉及到的基因主要有p16、CDH1等^[3]。为了解血浆DNA甲基化和DNMT 1mRNA与肝癌发生发展的相关性，本研究采用PCR技术对2011年8月—2013年8月在齐齐哈尔医学院第二附属医院就诊肝癌患者血浆p16基因和RASSF1A基因异常甲基化和DNMT 1mRNA水平进行检测，现将结果报告如下。

(1)对象：选取2011年8月—2013年8月在齐齐哈尔医学院第二附属医院就诊的肝癌患者120例为研究对象，男性91例，女性29例，年龄23～82岁，平均年龄为(53.16±13.23)岁。随机选取同期来齐齐哈尔医学院第二附属医院健康体检的120人作为健康人群对照组，其中男性92人，女性28人，年龄22～80岁，平均年龄为(51.34±14.06)岁。肝癌组纳入标准：①所有病例均经影像学和病理学确诊；②无严重的系统性疾病以及精神疾病；③所有对象均由医师告知研究内容并征得患者及家属知情同意。排除标准：肝硬化、肝脓肿、肝内胆管结石、肝囊肿、脂肪肝、合并有严重心肺疾病者等。(2)主要仪器与试剂:福尔马林固定石蜡包埋的方法处理(formally fixed and paraffin embedded)组织DNA提取试剂盒(美国Omega公司)；S7820 CpGenomeDNA化学修饰试剂盒(美国Chemicon公司)；Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(北京Promege公司)；PCR试剂(上海生工公司)；PCR仪PE7500(美国ABI公司)；胃蛋白酶、预杂交液、核固红试剂(武汉博士德公司)；dNTP mix及Taq DNA 聚合酶Promega Taq HS (美国 Promega公司)。(3)方法:①提取血浆DNA及肝组织标本DNA提取参照文献[2]进行。组织标本提取在无菌条件下，取肝癌患者组织标本20 mg，生理盐水冲洗至干净，按FFEP组织DNA提取试剂盒提取组织DNA，并参照Trizol说明书提取细胞中总RNA。②甲基化特异性PCR:加入p16或RASSF1A引物对，进行p16或RASSF1A甲基化特异性PCR反应。按试剂盒操作要求进行。③原位杂交检测:在120例肝癌患者做完手术取下癌组织病理标本后，对标本进行原位杂交检测。④结果分析：利用检测得到的Ct值和计算得到的扩增效率，计算mRNA的相对表达量。DNMT 1mRNA阳性判定方法：阳性细胞数>20%为阳性，0～20%为阴性。(4)统计分析：应用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料比较采用t检验；对计数资料组间比较和相关性采用χ²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

(1)基因甲基化检出情况：120例肝癌患者血浆DNAp16和RASSF1的基因甲基化检出率分别为68.33%(82/120)和43.33%(52/120)，而对照组血浆中均未检出DNAp16和RASSF1的基因甲基化。(2)DNMT 1mRNA检出情况：肝癌组和对照组血浆DNMT 1mRNA检测结果显示，肝癌组表达量(1.23±0.18)明显高于对照健康人群组(0.15±0.08)，差异具有统计学意义(t=16.2，P<0.05)。(3)DNA基因甲基化与DNMT 1mRNA表达的相关性:对120例肝癌患者术后标本做原位杂交检测，肝癌组织DNMT 1mRNA阳性率为91.67%(110/120)，DNA基因与癌组织中DNMT 1mRNA相关分析，结果显示，血浆p16、RASSF1甲基化分别与DNMT 1mRNA表达相关系数为r=0.679和r=0.406，均呈正相关(P<0.05)。

研究表明，DNMT 1mRNA在多种肿瘤细胞如胆管癌、胃癌、子宫内膜癌中均出现酶活性增强和表达异常增高^[4]。p16基因异常甲基化参与了多种肿瘤的发生，RASSF1A基因在所有组织中均表达，但在癌组织和肿瘤细胞系中出现表达缺失的频率较高^[5]。本研究表明，肝癌患者血浆p16基因和RASSF1A基因的甲基化明显高于健康人群，且血浆p16基因和RASSF1A基因超甲基化与DNMT 1mRNA过表达呈正相关。综上所述，血浆p16基因和RASSF1A基因异常甲基化、DNMT 1mRNA的高表达在肝癌的发生发展中可能起了重要作用，这提示其可作为肝癌筛查的分子生物标志物进一步研究。