骨骼的生长发育对儿童成长有着非常重要的意义，体现骨骼质量最重要的参数是骨密度(bone mineral density，BMD)^[1-2]。定量超声(quantitative ultrasound，QUS)是一种无辐射、无创伤、高精度的骨密度检测方法，目前已经在骨质疏松诊断领域获得广泛应用^[3]。骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)是一族转化生长因子，能够诱导骨质形成。其中BMP2是一种重要的细胞分泌型配体，有诱导胚胎干细胞向软骨细胞分化的能力,一度被尝试用于骨再生的基因治疗^[4]。目前已有研究证实BMP2的109T＞G位点的基因多态性可能与中国人身高水平相关^[5]。本研究于2011—2013年选取河南省南阳市901名5～12周岁儿童进行调查，以明确BMP2的基因多态性与中国儿童BMD等相关健康指标的关联，了解BMP2基因109T＞G位点多态性与BMD关系，现将结果报告如下。

于2011年2月—2013年11月在南阳市12所小学中，随机抽取5～12周岁儿童901人，其中男童481人，占53.4%；女童421人，占46.6%。平均年龄(8.2±2.3)周岁。城市儿童380人，占42.2%；农村儿童521人，占57.8%。

采用自制问卷调查的方式收集年龄、性别、健康状况、生活习惯、家庭情况、户外活动等。入组的所有儿童本人及其监护人均已签署知情同意书。

由专业人员以标准方法测量每个儿童的身高、体重，计算儿童的体质指数(body mass index，BMI)。

由专业技术人员操作以色列阳光(Sunlight)公司TM7000P型号的超声骨密度仪，使用标准方法测定超声在左胫骨中的段传播速度值(speed of sound，SOS)，并以Sunlight公司提供的同龄同性别亚洲儿童SOS值的Z值分数作为标准，其中Z≥-1者为健康，Z<-1者为骨强度不足^[5]。

静脉采血2 mL，加入适量乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(北京鹏彩精细化工有限公司)；使用标准碘化钠法^[6]提取血细胞的基因组DNA，现提现用。

由北京擎科生物技术有限公司合成PCR反应所需引物，根据NCBI上的参考序列，合成上游引物序列5′-CAGATTACTCATGGATCTGC-3′；下游引物序列：5′-AGGACTGATGGATGCGGTT-3′。

PCR反应体系为20 μL：DNA模板量为1 μg，l pmol浓度的上下游引物，10 μL的 2×PCR Master Mix(日本Takara公司)，用ddH₂O补充至总体积为20 μL。qPCR反应条件：94 ℃ 预变性90 s，三步法扩增25个循环(94 ℃ 20 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 20 s)；最后72 ℃延伸10 min。

反应体系：10 μL的PCR产物，2 μL的AlwNⅠ限制性内切酶(New England Biology，PA)，2 μL的AlwNⅠ10×缓冲液。反应条件：充分混匀，37 ℃水浴反应12 h。反应完毕后，取4 μL的反应产物，上样于2%琼脂糖凝胶，在TAE缓冲液中80 V电泳20 min，在凝胶成像分析系统(Applied Biosystems，SA)下进行基因型分析。

采用SPSS 17.0软件进行分析；BMP-2基因型与各类亚组因素(包括年龄、性别、家庭户籍等)的关联比较采用Pearson χ²检验；不同BMP-2的 rs967417位点各基因型间计量数据(包括BMI、SOS等)的比较采用独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 基本人口学特征 (表 1)

将901人入组的儿童按性别、年龄、户籍等因素划分亚组，分析各亚组人群在BMP2基因109T＞G位点多态性的分布。各亚组儿童的BMP2基因在109T＞G位点多态性的分布差异无统计学意义(P>0.05)。

表 1

表 1 BMP2基因109T＞G位点多态性的分布 亚组 基因型(n=901) Hardy-Weinberg平衡检验 TT TG GG χ2值 P值 χ2值 P值 性别 男童 281 175 24 1.33 0.516 0.11 0.74 女童 242 163 16 3.25 0.07 户籍 城镇 223 143 14 1.14 0.566 2.37 0.12 农村 300 194 27 0.37 0.54 年龄(岁) ≤8 236 135 19 2.31 0.316 0.01 0.96 ＞8 287 202 22 3.39 0.07

表 1 BMP2基因109T＞G位点多态性的分布

在研究总人群中BMP2基因型的频率分别为：TT型58.0%(523/901)，TG型37.5%(338/901)，GG型4.5%(40/901)，等位基因T/G的实际频率分别为76.7%(1 384/1 802)和23.3%(418/1 802)，符合 Hardy-Weinberg平衡(χ²=2.073，P=0.150)。

901名儿童SOS平均水平为(2 187.52±303.89)，男童SOS平均水平为(2 201.12±299.31)，女童SOS平均水平为(2 167.81±310.29)，差异无统计学意义(t=1.64，P=0.102)；城镇与农村户籍儿童SOS平均水平分别为(2 248.01±265.12)、(2 165.23±342.23)，差异有统计学意义(t=3.92，P<0.001)；≤8岁儿童390人，SOS平均水平为(2 124.81±303.10)，＞8岁儿童511人，SOS平均水平为(2 239.71±271.41)，差异有统计学意义(t=5.984，P<0.001)。

TT基因型儿童SOS值为(2 231.31±242.37)，TG+GG基因型儿童SOS值为(2 189.18±290.16)，二者差异有统计学意义，(t=2.37，P=0.018)。根据Sunlight公司提供的亚洲儿童SOD的Z值作为标准，本研究组对901名儿童的骨强度水平进行判断，其中TT基因型儿童骨强度不足者占29.8%(156/523)，TG+GG基因型儿童骨强度不足者占36.5%(138/378)，差异有统计学意义(χ²=4.155，P=0.041)，TG+GG基因型骨强度不足的比例明显高于TT基因型，相对风险OR(95%CI)为0.739(0.558～0.979)。TT基因型的儿童SOS水平高于TG与GG基因型儿童，而血清磷水平上低于TG与GG型儿童，即BMP2基因109T＞G位点的多态性可能通过对骨组织中磷的溶解性的作用来影响中国儿童的骨质。

目前骨密度的检测方法有多种，主要包括singh指数评定、单光子吸收仪、定量CT、超声骨密度仪等，其中定量CT和超声在临床上使用最为广泛^{[7 - 8]}。超声骨密度仪利用超声波的特性，通过检测骨中超声波传递速度和宽带超声波的衰减等指标对骨密度进行评估，其测定敏感部位主要为跟骨，对于发育期的儿童骨质状况有很好的代表性，且具有无辐射、无创伤、高精度的特点^[9]。
儿童的骨密度参数，常常会受到遗传因素和环境因素的双重影响，现有的各项研究均表明儿童的骨密度参数与多个基因的SNP具有非常显著的关联。BMP2与骨质发育有明确功能学关联，其编码基因序列的改变极有可能影响到儿童骨密度的发育情况。
研究表明，BMP2基因型的频率分别为：TT型58.0%(523/901)，TG型37.5%(338/901)，GG型4.5%(40/901)，等位基因T/G的实际频率分别为76.7%和23.3%。研究还发现在不同年龄、性别、户籍的儿童中BMP2基因的各基因型频率无显著差别，而且不同基因型的儿童在体重、身高、BMI等基本身体素质指标上差异无统计学意义。
本研究发现TT基因型的儿童SOS水平高于TG与GG基因型儿童，而血清磷水平上低于TG与GG型儿童，即BMP2基因109T＞G位点的多态性可能通过对骨组织中磷的溶解性的作用来影响中国儿童的骨质，提示BMP2可能会对骨质中磷的溶解性产生一定影响，但其具体机制仍需后续研究，尤其是生理生化试验的验证。