转基因食品(genetically modified food，GMF)是指利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植物和微生物生产的食品和食品添加剂^[1]。转基因作物即特指由转基因植物生产的食品，根据国际农业生物技术组织(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)统计，截至2012年全球已有1.7亿公顷的转基因作物在全世界28个国家种植生产，总量已经比1996年增加了100倍^[2]。随着大批转基因作物的种植，其食用安全性问题也越来越受到人们的关注^{[3, 4]}。一个世界各国认同的转基因食品安全评价体系亟待建立^[5]。作为安全性评价的重要领域之一，致敏性评价动物模型的标准化愈发成为国内外研究的焦点。现将转基因作物致敏性评价动物模型的研究进展综述如下。 1 食物过敏基本机制

食物过敏(food allergy)是免疫系统对食品中外源性无害蛋白的一种反应，表现为口服耐受机制的破坏^[6]，引发一系列的反应也可以分为消化系统局部和全身性变态反应^[7]。据统计世界范围内约6%~8%的儿童和1%~2%的成人受到食物过敏影响^[8]，因此食物过敏已成为国际社会关注的食品安全问题。一般来说，食物过敏是由IgE介导的I型超敏反应，即速发型超敏反应，包括致敏和发敏2个阶段。当易感者首次接触大量致敏原时激发抗体反应，致敏原选择性激活CD4+ Th2细胞并诱发其分泌细胞因子，在Th2细胞释放的白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)和IL-13以及Th1细胞产生的γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)和IL-2(起拮抗作用)协调作用下诱导产生IgE抗体。细胞因子还可激发并增强肥大细胞(mast cell,MC)和嗜碱性粒细胞(basophil,Bas)发育、定位及生理功能^[9]。IgE 与MC、Bas膜表面特定受体结合，成为致敏靶细胞，从而使机体处于致敏状态。当机体再次接触相同致敏原时，致敏原与靶细胞表面的IgE发生特异性结合后，肥大细胞与嗜碱性粒细胞被活化并释放具有生物活性的炎症介质引起小血管扩张，通透性增加，平滑肌收缩，支气管收缩，从而引发过敏反应^[10]。 2 转基因作物致敏性评价策略与程序

转基因作物食用安全性评价一般包括毒性、致敏性和营养学等方面的内容，而致敏性评价是转基因作物食用安全性评价的关键部分，也是转基因食品区别于其他食品安全性评价的重要特征，目的在于保护食物过敏者暴露于可能性致敏原或交叉致敏原的致敏性风险^[11]。目前国际上尚无标准方法预测人类对新表达蛋白的过敏反应，一般遵循实质等同^[12]原则，运用判定树分析法^[13]，进行转基因作物致敏性评价。2001年，判定树分析法又增加了定向筛选血清学试验和动物模型试验使其树状策略更加完善，成为当今国际上对转基因食品致敏性评价的基本方法。2003年国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission，CAC)对来自未知致敏原的转基因食品的致敏性的评价方法进行了进一步补充，推荐采用证据权重方法进行综合评估，而不能采用任何一种单一的因素判定^[14]。另外转基因食品致敏性评价中的两类非预期效应：外源基因激活或抑制宿主基因使特定表达蛋白过度表达或低表达，也是致敏性检验和评价中的特殊问题^[15]。

此外，转基因作物上市后的监测也是致敏性评价的一部分，许多国家均颁布法规或建立登记制度对转基因食品进行监督管理，保证转基因食品的食用安全性^[16]。建立不良反应报告系统^[17]，记录与致敏性相关的临床结果及其与特定转基因食品成分的因果关系也有助于转基因食品上市后的监管。 3 转基因作物致敏性评价动物模型应用

目前应用于致敏模型的动物种属一般包括啮齿类和非啮齿类，前者主要包括小鼠、大鼠和豚鼠，后者包括狗和猪等。鉴于食物过敏机制的复杂性，单独一种动物模型很难完成所有研究目的，还未发现某一种动物模型能够完整预测转基因食品的潜在致敏性，因此需要研究者根据研究目的和模型特点进行有针对性的选择^[18]。 3.1 啮齿类动物模型 3.1.1 挪威棕色(Brown Norway，BN)大鼠

BN大鼠对食物蛋白高IgE应答能力的表现，使它成为目前较为公认的具有应用前景的动物致敏模型^{[19, 20]}。免疫印迹实验证明，经口致敏的BN大鼠血清与鸡蛋清或牛奶过敏病人血清识别相似的食物致敏原，表明BN大鼠诱导产生抗体对特异性蛋白的识别与过敏病人血清中观察到的现象相似^[21]。对Wistar、Piebald Virol Glaxo(PVG)、Hooded Lister(HL)和BN等不同品系大鼠进行经口卵清蛋白(ovalbumin，OVA)试验，发现只有BN大鼠明显激发产生OVA特异性IgE抗体，也进一步证明BN大鼠是经口致敏研究最适宜的大鼠品系^[22]。

目前致敏性动物模型研究通常采用鸡蛋中的过敏原OVA作为阳性对照蛋白，或使用鸡蛋清粗提蛋白质(hen’s egg white protein，HEWP)进行研究，结果发现2者均可激发BN大鼠发生过敏反应^[23]。Knippels等^{[24, 25]}在连续42 d经口给予BN大鼠1 mg/d OVA，无佐剂情况下，通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和被动皮肤过敏反应试验(passive cutaneous anaphylaxis，PCA)，发现产生OVA特异性IgE的大鼠超过80%，最佳OVA特异性IgE抗体应答时期在28~35 d。进一步对BN大鼠致敏模型进行局部效应研究时发现，经口给予OVA再次激发已OVA致敏的BN大鼠时，其肠道对β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG)吸收性增加，表明肠通透性增加^[26]，同时监测呼吸功能和血压变化反映全身效应，亦发现在相同实验条件下，动物呼吸或血压变化不明显，故认为BN大鼠低过敏反应发生率与食物过敏患者临床观察一致。在对阴性对照蛋白进行的研究中发现，牛肉原肌球蛋白和土豆酸性磷酸酶不会激发可检测到的IgE抗体反应^[27]。贾旭东等^{[28, 29]}已尝试利用已建立的BN大鼠致敏模型进行某些外源基因表达蛋白和转基因全食品的致敏性评价。但BN大鼠模型致敏的可重复性尚待验证，标准的建立也需进一步讨论。 3.1.2 Balb/c小鼠

Balb/c小鼠属于近交高IgE应答品系，因优先产生Th2型免疫应答和IgE抗体而被应用于致敏模型研究^{[30, 31]}。Balb/c小鼠可经口给药，但更适用于腹腔注射途径，用以判定蛋白质的内在致敏性^[32]。现有Balb/c小鼠致敏模型多经腹腔注射纯化蛋白，有的辅之以佐剂，避免了经口耐受而成为一种有用的致敏动物模型。Kimber等^[31]研究发现，腹腔注射不同浓度蛋白或使用3种不同潜在致敏性蛋白，均可使Balb/c小鼠产生强烈的IgG和IgE体液免疫反应，因而认为该小鼠模型是筛选蛋白潜在致敏性的有效模型。Dearman等^[30]也发现，可以使用Balb/c小鼠模型通过免疫反应的强度来判定激发明显IgE抗体反应的蛋白的内在致敏可能性(inherent sensitizing potential)，即鉴别免疫原性蛋白(immunogenic proteins)和潜在致敏性蛋白(potentially allergenic proteins)，前者可诱导产生特异性IgG抗体反应而无IgE反应，后者则可诱导IgG和IgE 2种抗体产生。

目前，对Balb/c小鼠能否用于食物过敏和转基因作物致敏性评价动物模型国内外尚存争议。Dearman等^{[33, 34]}发现，经口和腹腔注射途径分别给予相同剂量的0.2%花生凝集素(peanut agglutinin，PNA)、2%OVA、10%含马铃薯酸性磷酸酶的粗马铃薯蛋白提取物(potato acid phosphatase，PAP)，结果显示，14 d后所有蛋白都能激发特异性IgG抗体反应，而同等条件下14、28和42 d后PNA和OVA均能激发强烈的IgE反应，PAP只能在28 d后检测出激发很弱的IgE抗体。Husain等^[35]也发现2%BLG、2%OVA和0.2%PNA经腹腔注射均能使Balb/c小鼠产生特异性的IgG和IgE抗体。李英华等^[36]将Balb/c小鼠分成4组，分别喂养转Xa21基因大米、非转基因大米、正常饲料和阳性对照饲料，结果发现转基因大米组与非转基因大米组小鼠免疫功能指标均无明显差异，而与正常饲料组比较，脾脏/体比值，自然杀伤细胞活性有所提高，但仍可认为转基因大米在小鼠免疫毒理学方面的评价是安全的。但也有研究表明，常见致敏食物蛋白质OVA和大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor，STI)、不常见致敏食物蛋白质牛血清白蛋白及无致敏史食物蛋白质PAP均可使Balb/c小鼠产生过敏反应，鉴于理想动物模型应对无致敏史蛋白不产生过敏反应，认为Balb/c小鼠不适合作为食物过敏动物模型^[37]。 3.1.3 C3H/HeJ小鼠

C3H/HeJ小鼠也属于高IgE应答品系，早期已应用于食物过敏机制的研究^[38]，研究发现，经口加佐剂的方式给予C3H/HeJ小鼠生花生、烤花生、鸡蛋清、火鸡、菠菜、土豆、和坚果等食物全蛋白可以区别出食物蛋白潜在致敏性的不同^{[39, 40]}。另有研究表明，无佐剂经口给予花生蛋白的C3H/HeJ小鼠致敏模型，两周内即表现出严重的过敏症状^[41]。由于C3H/HeJ小鼠属于Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)基因突变型小鼠，能够很好地通过经口途径致敏^[42]，可能更适用于研究食物过敏的发生机制。Capobianco等^[43]对周龄和性别相同的C3H/HeJ和Balb/c小鼠进行比较研究后发现，2种小鼠均可通过经口途径致敏，但相同致敏原再次激发时仅C3H/HeJ小鼠产生过敏反应，Balb/c小鼠则未发生过敏反应。这主要由于C3H/HeJ小鼠的TLR4基因发生点突变阻碍了脂多糖的信号传递，而使特异过敏反应发生。 3.2 非啮齿类动物模型

随着致敏性动物模型研究的深入，非啮齿类动物逐渐得到研究者的关注，特别是在过敏性疾病研究方面，由于需要关注动物皮肤、呼吸道和胃肠道临床症状的改变，因而大型动物如狗和猪等更加适用^[44]。这些非啮齿类动物对天然过敏食物具有明确的临床和免疫学表现，在解剖、生理、营养需要等方面与人类有更好的同源性^[6]，免疫病理学、机制学、治疗性干预策略等与人类接近，遗传性能稳定，能够反复多次进行胃肠道内窥镜观察，可获得大量免疫器官和细胞等等^[45]。

猪在研究致敏原发病机理和免疫应答方面有许多优势，如在胃肠道生理、粘膜免疫发育及先天免疫反应活性等与人类近似，使得利用猪进行免疫反应评价更为有效。五指山小型猪是最为常用的转基因作物致敏性评价非啮齿类动物模型，主要原产自中国海南岛山区和越南，由于其体型和性状个体差异小、发育慢、遗传背景一致等优点近年来己逐渐应用于食物过敏的研究。研究发现11S大豆抗原蛋白诱发的五指山小型猪食物致敏模型属IgE介导超敏反应类型,4%剂量组较8%剂量组过敏反应更明显,激发期是观察和比较仔猪过敏反应的较佳时点,过敏反应可能与小肠肥大细胞活化有关^[46]。刘洪亮等^[47]使用转bar基因耐草铵膦油菜和亲本对照油菜对小型猪进行30 d喂养，未发现小型猪的免疫指标发生任何改变。Helm等^[48]建立了小型猪经腹膜致敏模型对花生蛋白进行致敏性研究。此外，狗作为研究食物致敏模型动物也具有可行性，因为狗表现出与人类过敏反应相似的临床症状(呕吐、腹泻等)，如具有遗传过敏性的贝吉生猎犬就是一种高IgE免疫应答且遗传稳定的近交品种，已成为食物致敏机制的有效研究工具^[49]。 4 小 结

致敏性评价是转基因作物食用安全性评价的重要环节，国际上已建立了较为系统的策略和程序，但评价方法还有待完善，需要进一步研究。致敏动物模型的建立在转基因作物致敏性评价中起着不可替代的作用，啮齿类动物模型更是得到广泛关注，一个高效的动物模型能够为转基因作物表达的新型蛋白的潜在致敏性提供准确、重要的证据，但每种动物模型本身又存在一定的局限性，且国内外尚无公认的致敏动物模型，因此，有必要进一步加强重复性验证和标准化研究，并对结果进行科学分析，以使其在转基因作物致敏性评价中发挥更重要的作用。