急性呼吸道感染是对人类健康危较大的传染病，其中＞90%由病毒引起，发病率高、传播快，常引起暴发和流行。2012年7月，在辽宁省沈阳市某寄宿制中学发生一起由腺病毒引起的急性呼吸道感染暴发疫情，从7月1日起在初一的3个班级中陆续出现发热病例，累计出现24例发热病例，患病的学生均出现了以发热、咽痛、头疼为主的临床表现，但症状较轻，无重症和死亡病例。为了解该起腺病毒感染的分子流行特征，本研究采集了其中10例症状典型的临床诊断患者咽拭子标本进行了病原学鉴定和病原体基因特征分析。结果报告如下。

2012年7月1日，沈阳市某寄宿制中学初一的一名男生出现发热、咽痛、腹泻及乏力等症状，当日在中国医科大学附属医院就诊，确诊为流感样病例，症状减轻后于7月2日和3日到校上课，其后居家隔离治疗，痊愈后于7月9日复课。之后1个月内，该患者同班级及其他班级陆续出现病例，3个班级78名学生中累计出现24例发热病例，发病率为30.77%。其中男生10例，女生14例；二班16例，三班7例，四班1例。患者中无重症和死亡病例出现。

在 2012 年 7月疫情暴发期间共采集10例症状典型、发病 3 d内的临床诊断患者咽拭子标本，采集后立即投入装有病毒采样液的小试管中冷藏运输至实验室。标本一部分用于核酸提取并进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，另一部分-70 ℃冰箱冻存用于病毒分离。

使用人喉癌上皮细胞(HEP-2)、狗肾细胞(MDCK)、恒河猴肾上皮细胞(LLC-MK2)、非洲绿猴肾细胞(VERO-E6)、人宫颈癌细胞(HELA)5种细胞进行病毒分离，细胞均为本单位细胞库保存。DMEM、MEM、小牛血清均为美国Gibco/BRL公司生产；青霉素和链霉素为中国沈阳东北制药厂生产。每份标本在5种细胞上至少传三代，如果不出现致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)，则判为阴性标本；如果出现CPE，则使用多重PCR方法进行鉴定。

采用EZ1Advanced XL全自动核酸提取仪(美国QIAGEN公司)和 EZ1 Virus Mini Kit V2.0(美国QIAGEN公司)进行核酸提取，具体步骤参考说明书。

采用 Promega^ Reverse Transcription System(美国QIAGEN 公司)和Seeplex^ RV12 ACE Detection(美国Seegene 公司)多重检验试剂盒进行PCR反应，并进行琼脂糖凝胶电泳。针对腺病毒六邻体(Hexon)基因的 L1 片段设计引物，ADF:5′-ATGTACTACAACAGCACTGGCAACATG-3′,ADR:5′-TTGCGGTGGTGGTTAAATGGGTTTACGTGGTC-3′。采用Promega PCR试剂盒(美国Promega公司)进行核酸检测，PCR产物目的片段约550 bp。

PCR测序结果进行在线BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，使用Sepman进行序列处理；Clastal X进行BLAST后，用MEGA 5.1和MegAlign进行进化树的构建和分析。系统发生树采用 MEGA 5.1 软件的邻近连接法(neighbor-joining，NJ)构建:test of phylogeny:bootstrap methed；No．of bootstrap replications:1 000；其余参数均为默认值。比对中所选腺病毒参考毒株序列均下载于 Genebank。

提取10份标本中病毒DNA，并以其为模板进行PCR。PCR产物经电泳鉴定，标本2、3、5、8、10所检测PCR产物条带大小与腺病毒目的条带大小一致，5份标本中病毒为均呼吸道腺病毒。

图 1

注：M：多重PCR Marker；1~10：咽拭子标本；11：阳性对照；12：阴性对照。 图 1 腺病毒鉴定凝胶电泳图

选用人喉癌上皮细胞(HEP-2)、狗肾细胞(MDCK)、恒河猴肾上皮细胞(LLC-MK2)、非洲绿猴肾细胞(VERO-E6)和人宫颈癌细胞(HELA)5种细胞进行病毒分离，将所采集的10份咽拭分别加入细胞中，每份标本在5种细胞上至少传三代，其中MDCK、VERO-E6及LLC-MK2未出现CPE；有5份标本在HEP-2及HELA出现了典型的CPE，标本号与多重PCR阳性标本号相一致。Hep-2细胞出现肿胀、变圆、聚集成葡萄串状的病变；HELA细胞了出现肿胀、变圆脱落的病变。

取CPE阳性的细胞培养产物，针对腺病毒六邻体 L1片段进行扩增，5份标本检测结果均出现特异性目的条带。

图 2

注：M：DNA Marker；1~5：病毒分离株。6：阴性对照。 图 2 毒株PCR反应凝胶电泳图

5份PCR扩增产物电泳、纯化后，送上海英骏生物公司进行测序。测序结果进行BLAST 比对及系统进化树分析。5株毒株之间Hexon L1 片段核苷酸序列完全一致，在线Blast比较发现与腺病毒14型高度同源，与Genebank中序列号为JX892927、JX310315 和JN032132的中国腺病毒14型参考株同源性最高，序列有100%的一致性；与序列号为AB330095日本参考株、FJ841902荷兰参考株和FJ841901波兰参考株同源性也高达99%。将这5株腺病毒序列分别命名为LN-1、LN-2、LN-3、LN-4、LN-5，与Genebank数据库上检索到14型腺病毒参考株序列和其他型别腺病毒参考株序列构建腺病毒Hexon L1 片段遗传进化树。LN-1、LN-2、LN-3、LN-4、LN-5与中国、日本、荷兰、波兰14型腺病毒参考株序列在系统树上均位于同一进化分支，属于人腺病毒B亚属。

腺病毒属腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，为无包膜二十面体线性双链DNA病毒。腺病毒是引起人类呼吸道和消化道感染的重要病原之一,迄今为止，已发现57种血清型，分属于7个不同亚组A～G。腺病毒14型属于B亚组，可引起从轻微呼吸道发热和结膜炎到潜在成年人和儿童的致死性疾病^[1]。在许多国家均有关于此病毒流行的报道，其中一次较大规模的暴发是在2007年美国暴发的疫情，这次疫情在美国纽约、奥勒冈、华盛顿和得克萨斯等4个州引起急性呼吸道疾病暴发，涉及各个年龄组人群，共有140例患者感染腺病毒14型，导致9例死亡，研究显示为腺病毒14型变异株所致^[2]。在亚洲，日本和韩国对腺病毒有连续多年的监测研究^[3,4]，而中国由于在2007年以前未发现腺病毒14型或14型变异株，所以有关腺病毒14型的研究及报道较少。

2012年7月，在辽宁省沈阳市某寄宿制中学发生一起急性呼吸道感染暴发流行疫情，1个月内在3个班级78名学生中累计出现24例发热病例，发病率为30.77%。采集发热学生咽拭子标本进行病毒分离培养，共分离到5株病毒。对病毒进行分子生物学鉴定，表明5株病毒均为腺病毒，其 Hexon L1 基因片段核苷酸序列完全一致，系统进化树上与人腺病毒 14 型参考株均位于同一分支，说明此次疫情是由同一传染源引发，即B亚属人腺病毒14 型。本研究所分离的毒株与近年来分离于中国其他各省份的腺病毒14型在系统进化树上均位于同一分支，同源性几乎达到100%，表明本研究所分离的毒株与之前中国所流行的腺病毒14型相比未发生基因变异。但由于近年来发现腺病毒重组情况时有发生，因此，获得本次暴发病毒分离株的基因序列仍有很高的分析价值。