中国公共卫生  2014, Vol. 30 Issue (7): 921-923   PDF    
引用本文
李双月, 朴丰源. OPIDN致鸡大脑脑型肌酸激酶差异表达[J]. 中国公共卫生, 2014, 30(7): 921-923.
LI Shuang-yue, PIAO Feng-yuan. Differential expression of CK-BB in brain tissue of hens with OPIDN[J]. Chinese Journal of Public Health, 2014, 30(7): 921-923.
OPIDN致鸡大脑脑型肌酸激酶差异表达
李双月, 朴丰源     
大连医科大学劳动卫生与环境卫生学教研室, 辽宁 大连 116044
数字出版日期：2014-6-5 8:54.
基金项目：国家自然科学基金（81102160；30771819）
作者简介：李双月（1978- ），女，黑龙江哈尔滨人，讲师，博士，研究方向：神经毒理学。
通讯联系人：朴丰源,E-mail：piaofy_dy@163.com
摘要：目的 探讨有机磷化合物致迟发性神经毒性（OPIDN）鸡脑组织中脑型肌酸激酶同工酶（CK-BB）表达变化。方法 罗曼鹤母鸡24只，随机分成三磷甲苯磷酸酯（TOCP）染毒组（1 000 mg/kg）、苯甲基磺酰氟（PMSF）干预组（在染毒之前给予40 mg/kg PMSF）和对照组（生理盐水），每组8只。染毒第5和第21天，每组分别处死8只动物，分离大脑，提取总蛋白；用双向电泳和质谱分析技术，筛选相关差异表达蛋白。结果 蛋白双向电泳结果显示，在染毒第5天，TOCP组与对照组、PMSF干预组与对照组的CK-BB蛋白点灰度比值分别为0.858 3和0.913 3，各组间差异无统计学意义（P>0.05）；染毒第21天，TOCP组和PMSF干预组与对照组差异蛋白点CK-BB灰度比值分别为0.327 5与0.675 7，前者表达下调达3.0倍；对该蛋白点的质谱分析结果在Swiss-por数据库中进行比对，其与鸡种属、蛋白序列号为gi|45384340的creatine kinase B-type（CK-BB）蛋白的肽段匹配数为26，序列覆盖率为75%，评分值为1 603（可信度高），显示该蛋白点即为CK-BB蛋白。结论 OPIDN可致鸡大脑组织CK-BB蛋白表达显著下调，其变化可能与OPIDN模型动物神经组织损伤有关。
关键词： 迟发性神经毒性(OPIDN)     脑型肌酸激酶同工酶(CK-BB)     三磷甲苯磷酸酯(TOCP)     苯甲基磺酰氟(PMSF)     双向电泳分析    
Differential expression of CK-BB in brain tissue of hens with OPIDN
LI Shuang-yue, PIAO Feng-yuan     
Department of Occupational and Environmental Health, Dalian Medical University, Dalian, Liaoning Prvince 116044, China
Abstract: Objective To detect differential expressions of brain type isoenzyme of creatine kinase(CK-BB)in the brain of hens with organophophors compounds induced delayed nerutoxicity(OPIDN)and to provide target protein evidence for diagnosis of POIDN.Methods Twenty-four Roman hens were randomly divided into three groups:treated group(1 000 mg/kg triorthocresyl phosphate,TOCP),intervened group(40 mg/kg phenylmethanesul fonyl fluoride [PMSF] before TOCP treatment),and control group(tap water).Eight hens in each group were sacrificed at day 5 and day 20 after the treatments;then,the brain tissue of the hens were seperated at low temperature and total protein of the brain tissue were extracted.With solid phase PH gradient sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)and two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry,we detected differently expressed CK-BB protein.Results Compared with the control group,the difference in CK-BB expression was not significant at day 5(P<0.05),while at day 20,the gray level ratio of CK-BB expression of treated-group and intervened-group were 0.327 5 and 0.675 7,with a three-fold down-regulation in the treated group.Mass spectrometry and Swiss-por data analysis identified CK-BB spot with peptide segments of 26,sequence coverage of 75%,and the assessment value of 1 603(≥45 for high reliability)in relation to the species of the hen and protein sequence number gi|45384340 of CK-BB.Conclusion The expression of CK-BB is down-regulated in the brain of hens with OPIDN,which may related to brain injury induced by OPIDN.
Key words: organophosphorus compounds induced delayed neurtoxicity(OPIDN)     brain type isoenzyme of creatine kinase(CK-BB)     triorthocresyl phosphate(TOCP)     phenylmethanesul fonyl fluoride(PMSF)     two-dimensional electrophoresis    

有机磷化合物(organophosphorus compounds,OPs)应用广泛,可引起人畜急性中毒甚至死亡。其中有些 OPs，在急性中毒症状消失后,经过 1~5周潜伏期，可诱发迟发性神经毒性(organophosphorus ester-induced delayed neuropathy,OPIDN)[1]。OPIDN模型的病理改变包括脑及脊髓局部灶性坏死、水肿、脱髓鞘改变及脊髓前角运动神经损害。动物实验及临床研究证实，急性颅脑损伤时，神经元和胶质细胞内的脑型肌酸激酶同工酶(brain type isoenzyme of creatine kinase,CK-BB)由胞液中立即释放，进入脑脊液和血液，可作为颅脑损伤诊断可靠的生化指标[2]。研究发现，苯甲基磺酰氟(phenylmethanesul fonyl fluoride,PMSF)对OPs诱发OPIDN有拮抗作用，但对OPs诱发的急性毒性却无

保护作用[3]。本研究利用双向电泳和质谱分析技术，在经典诱发剂三磷甲苯磷酸酯(triorthocresyl phosphate,TOCP)致OPIDN的鸡脑组织中筛查差异表达蛋白CK-BB，为OPIDN诊断新指标的确立提供依据。 1 材料与方法 1.1 主要试剂

TOCP(纯度＞99%，日本关东化学公司)；电泳试剂质谱分析试剂及显色试剂(美国Sigma公司)；其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。 1.2 动物分组与处理

参照文献[4]，将罗曼鹤母鸡24只(体重1.5～2.0 kg，大连市韩伟养鸡场)随机分成TOCP染毒组(1 000 mg/kg)，PMSF干预组(在染毒之前给予40 mg/kg PMSF)和对照组(生理盐水0.6 mL/kg)，每组8只，染毒后第5和第21天分别每组处死4只，低温环境下分离大脑，在-80 ℃冰箱保存备用。 1.3 蛋白质双向电泳分析

电泳上样为100 μg蛋白，第一向使用IPGphorIEF System等电聚焦仪，18 cm pH 3～10的干胶条，按仪器说明书操作；第二向采用12%的分离胶，对胶条银染法染色。利用Amersham Pharmacia Biotech公司的双向凝胶专用透射扫描仪扫描凝胶。蛋白点采用2-DE图像分析软件Image Master 2D Platinum 5.0进行图像分析，蛋白表达差异＞2倍或<0.5倍为差异表达有统计学意义。选择与对照组比较在TOCP组差异表达有统计学意义，且在PMSF前干预组差异无统计学意义的蛋白匹配点，作为与OPIDN相关蛋白点。 1.4 质谱鉴定

通过2-DE图像分析软件Image Master 2D Platinum 5.0进行双向电泳图像分析筛选与对照组比较，TOCP组差异表达有统计学意义，且PMSF干预组表达差异无统计学意义的蛋白匹配点，作为可能的差异表达蛋白点进行质谱鉴定。即从凝胶上切下这些蛋白点，依次脱色还原烷基化冻干酶解后，将制备好的样品进行点样和质谱分析，获得肽质量指纹图谱。通过数据库检索分析，确定蛋白质性质。肽指纹图谱允许误差0.3 D，相对分子质量允许误差±20%。 2 结 果 2.1 鸡大脑组织蛋白双向电泳扫描图差异(图 1)

结果显示，染毒第5天，TOCP组与对照组、PMSF干预组与对照组的CK-BB蛋白点灰度比值分别为0.858 3和0.913 3，各组间比值没有明显差异；染毒第21天(图 1，图中黑色圆圈即为CK-BB蛋白点)，TOCP组与对照组CK-BB蛋白点灰度比值为0.327 5，其表达下调达3.0倍，差异有统计学意义(P<0.05)；PMSF干预组与对照组的CK-BB蛋白点灰度比值为0.675 7，差异无统计学意义。

注：A：对照组；B：TOCP染毒组；C：PMSF干预组；a,b,c:CK-BB蛋白点。 图 1 染毒第21天鸡大脑组织CK-BB双向电泳扫描图
2.2 质谱鉴定结果(图 2)

对上述筛选的蛋白点做Maldi-Tof质谱鉴定，用Data Explorer TM显示肽质量指纹图(PMF)进行基线调整，去除干扰峰滤过核素峰和提取肽质量数据到Swiss-por进行查询。该蛋白点的PMF如图 2所示，其PI/MW为5.93/42 844，肽段匹配数为26，序列覆盖率为75%，评分值为1 603(评分值≥45即表示可信度高)，与Swisspor数据库中鸡种属、蛋白序列号为gi|45384340的creatine kinase B-type(CK-BB)蛋白匹配，表明所得到的差异蛋白即为CK-BB蛋白。

图 2 CK-BB肽质量指纹图谱
3 讨 论

CK-BB是肌酸激酶的脑型同工酶，主要存在于脑组织细胞中。当脑组织因外伤、严重缺氧等病因引起脑组织细胞膜破裂时，CK-BB由细胞内释放到细胞外液。1976年，Itano发现中枢神经系统损伤患者的血浆CK-BB浓度增高，并且CK-BB主要来源于损伤的脑组织[5]。之后的一系列研究显示，CK-BB含量的检测对诊断神经组织创伤具有明显的特异性，并且可以用来反映脑损伤程度及预后情况[6, 7]。OPIDN动物模型较明显的病理改变是神经组织局灶性坏死、水肿、脱髓鞘改变及神经细胞损伤。此时，损伤脑组织细胞中的CK-BB从细胞中释放，损伤组织局部的CK-BB含量降低。

本研究结果显示，染毒第5和21天，通过双向电泳技术从TOCP暴露组的鸡脑组织中筛选出与对照组比较表达差异有统计学意义，且与PMSF干预组无明显差异的相应蛋白匹配点，再通过质谱分析进行蛋白质定性，并从中筛选差异表达的CK-BB蛋白，结果表明，OPIDN具有下调CK-BB蛋白表达的作用。OPIDN致CK-BB表达异常可能与脑组织损伤有密切关系。文献报道，神经组织损伤时神经细胞内的CK-BB可释放入脑脊液和血清中[5, 8]，CK-BB可作为OPIDN的生物学诊断指标。因此，今后有必要进一步证实OPIDN动物模型中CK-BB在脑脊液和血清中的浓度变化，从而为寻找迟发性神经毒性疾病的病情判断、预后评估指标提供参考依据。

参考文献
[1] Abou-Donia MB.Organophosphorus ester-induced delayed neurotoxicity[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,1981,21:511-548.
[2] Hergenroeder GW,Redell JB,Moore AN,et al.Biomarkers in the clinical diagnosis and management of traumatic brain injury[J].Mol Diagn Ther,2008,12(6):345-358.
[3] 朴丰源.苯甲基磺酰氟对有机磷化合物诱导的迟发性神经毒性的影响[J].大连医科大学学报,2009,31(2):123-127.
[4] 张彦宁,朴丰源,吕飞燕,等.PMSF对TOCP暴露鸡腰髓组织蛋白表达谱影响[J].中国公共卫生,2011,27(10):1266-1268.
[5] Kaste M,Hernesniemi J,Somer H,et al.Creatine kinase isoenzmes in acute brain injury[J].J Neurosurg,1981,55(4):551-555.
[6] Bakay RA,Ward AA Jr.Enzymatic changes in serum and cerebrospinal fluid in neurological injury[J].J Neurosurg,1983,58(1):27-37.
[7] Hans P,Alber A,Franssen C,et al.Improved outcome prediction based on CSF extrapolated creatine kinase BB isoenzyme activity and other risk factors in severe head injury[J].J Neurosurg,1989,71(1):54-58.
[8] Delanghe JR,De Winter HA,De Buyzere ML,et al.Mass concentration measurements of creatine kinase BB isoenzyme as an index of brain tissue damage[J].Clin Chim Acta,1990,193(3):125-135.