中国公共卫生  2014, Vol. 30 Issue (7): 918-920   PDF    
引用本文
方芳, 廖慧娟, 张灵, 郭亦然, 朱优鹏, 王立国. CD147对LNCaP-AI细胞生长影响[J]. 中国公共卫生, 2014, 30(7): 918-920.
FANG Fang, LIAO Hui-juan, ZHANG Ling, et al. Impact of CD147 on growth of prostate cancer LNCaP-AI cell line[J]. Chinese Journal of Public Health, 2014, 30(7): 918-920.
CD147对LNCaP-AI细胞生长影响
方芳1, 廖慧娟1, 张灵1, 郭亦然1, 朱优鹏1, 王立国2     
1. 吉林医药学院检验学院, 吉林 吉林 132013;
2. 吉林医药学院附属医院泌尿外科
数字出版日期：2014-6-5 8:57.
基金项目：国家自然科学基金（81202031）；吉林省科技厅科技发展计划项目（20130101154JC）；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究重点项目（吉教科合字2013第346号）；吉林省教育厅“十二五”教育技术研究项目（吉教科合字2012第333号）
作者简介：方芳（1973- ），女，吉林长春人，副教授，博士，研究方向：前列腺癌的机制研究。
通讯联系人：王立国,E-mail：urolancet@sina.com
摘要：目的 观察RNA干扰白细胞分化抗原147（CD147）基因对雄激素非依赖性前列腺癌LNCaP-AI细胞增殖、细胞周期和凋亡影响。方法 脂质体2000转染靶向CD147基因的shRNA质粒到LNCaP-AI细胞中，通过G418筛选获得稳定低表达CD147细胞株。利用溴化四氮唑蓝法和流式细胞术检测CD147基因沉默后对细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果 与对照组比较，沉默CD147表达后明显抑制LNCaP-AI细胞增殖（P<0.05）；细胞周期出现在G0/G1期细胞百分率从（69.76±3.83）%增加到（79.40±4.02）%，差异有统计学意义（P<0.05）；S期和G2/M期细胞百分率分别从（23.51±2.58）%、（6.73±0.70）%减少到（17.03±2.02）%和（3.57±0.21）%，差异有统计学意义（P<0.05），呈现G0/G1期细胞阻滞；但不引起细胞凋亡。结论 RNA干扰CD147基因能够抑制LNCaP-AI细胞增殖，诱导细胞周期异常。
关键词： RNA干扰     白细胞分化抗原147(CD147)     雄激素非依赖性前列腺癌     细胞周期     凋亡    
Impact of CD147 on growth of prostate cancer LNCaP-AI cell line
FANG Fang1, LIAO Hui-juan1, ZHANG Ling1, et al    
Department of Laboratory, Jilin Medical College, Jilin, Jilin Province 132013, China
Abstract: Objective To study the effects of targeting cluster of differentiation 147(CD147)RNA interference(RNAi)on cell proliferation,cell cycle and apoptosis of androgen-independent prostate cancer LNCaP-AI cell line.Methods The shRNA vector targeting CD147 gene was transfected into LNCaP-AI cells by Lipofectamine 2000.The stable cell line with down-regulated CD147 was obtained after G418 screening.The cell proliferation,cell cycle and apoptosis were detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay and flow cytometry,respectively.Results Compared with the control group,silencing expression of CD147 in LNCaP-AI cell significantly inhibited cell proliferation(P<0.05).The percent of G0/G1 phase cells increased from 69.76±3.83%to 79.40±4.02%(P<0.05),S and G2/M phases cells decreased from 23.51±2.58%to 17.03±2.02%and from 6.73±0.70%to 3.57±0.21%,respectively(P<0.05),which showed that G0/G1 phase of experiment cells were arrested.There was no obvious difference in the RNAi transfected cells in apoptosis.Conclusion Downregulation of CD147 via RNAi technology could decrease the cell proliferation and induce aberrant cell cycle.
Key words: RNA interference     CD147     androgen-independent prostate cancer     cell cycle     apoptosis    

白细胞分化抗原147(cluster of differentiation 147,CD147)亦称细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)，是分子量为50~60 kD单次跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。CD147在前列腺癌(prostate cancer,PCa)的组织和细胞中均高表达[1, 2]，其表达水平与肿瘤的侵袭和转移[2]、血管生成[3]和能量代谢[4]等密切相关。前期研究利用雄激素依赖性前列腺癌(androgen-dependent prostate cancer,ADPC)细胞系LNCaP，在体外应用激素递减法建立雄激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer,AIPC)细胞模型LNCaP-AI[5]，成为研究AIPC的发生及其分子机制理想的肿瘤细胞模型。本研究应用RNAi沉默CD147基因表达，观察对体外培养的LNCaP-AI细胞增殖、细胞周期以及细胞凋亡的影响。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料

活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清(DCC-FBS)(美国Hyclone公司)；无酚红1640(美国Sigma公司)；LipofectamineTM2000和G418(美国Invitrogen公司)；总RNA/mRNA提取试剂盒和reverse transcription(RT)-PCR试剂盒(北京鼎国公司)；兔抗CD147和β-actin抗体(美国GeneTex公司)。pSilencer-Scramble和pSilencer-CD147干扰载体(吉林医药学院检验学院实验室)。LNCaP-AI细胞系由吉林医药学院检验学院实验室利用LNCaP细胞系通过雄激素递减法建立[5]。细胞培养在10%DCC-FBS的去酚红1640中。置于37 ℃恒温培养箱中培养，取指数生长期细胞进行实验。 1.2 指标与方法 1.2.1 干扰CD147表达的稳定细胞系建立

根据Lipofectanmine 2000操作手册将pSilencer-Scramble载体(阴性对照)和pSilencer-CD147干扰载体(CD147沉默)分别转染到LNCaP-AI细胞中，挑取在G418压力筛选下存活的克隆，消化并转移细胞继续培养，将细胞分别命名为AI/Scramble(阴性对照组)和AI/shCD147(CD147沉默组)。 1.2.2 CD147基因表达检测

采用RT-PCR法，用总RNA/mRNA提取试剂盒提取总RNA，取细胞总RNA 1 μg，以Oligo(dT)为引物反转录为cDNA，采用RT-PCR方法检测CD147在mRNA水平上的表达，以β-actin作为内参。CD147引物上游：5′-aaggtggactccgacgaccagtgg-3′，下游：5′-cttccggcgcttctcgtagatgaag-3′；β-actin引物上游：5′-atcatgtttgagaccttcaaca-3，下游：5′-catctcttgctcgaagtcca-3，实验采用}反应体系。反应条件94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s 进行30 个循环扩增反应后72 ℃ 10 min延伸。对扩增基因在1.2%胶浓度并含溴化乙锭的琼脂糖上进行电泳。 1.2.3 CD147蛋白水平表达检测

采用Western blot法，取40 g 蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，将凝胶上蛋白移至醋酸纤维素膜，于50 g/L 脱脂奶粉中4℃封闭过夜，加兔抗CD147抗体(1∶1 000)，小鼠抗β-actin抗体(1∶3 000)，4 ℃过夜。磷酸缓冲盐溶液吐温(phosphate buffered saline tween,PBST)洗膜，分别加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(1∶3 000)室温避光孵育2 h。TBST洗膜后，加底物电化学发光显影。使用Quantity One软件扫描并做灰度分析。 1.2.4 细胞增殖检测

取对数生长期细胞，以台盼蓝检测活力大于95%细胞，以1 500个/孔密度接种于96孔细胞培养板，每孔体积200 μL，分组培养2、4、6、8和10 d，各时间点均设3个复孔。培养结束后加入5 mg/mL噻唑蓝20 μL/孔，37 ℃，5%CO2继续孵育4 h，小心吸弃上清，加入二甲基亚砜150 μL/孔，充分混匀，于Bio-Tek 酶标仪490 nm 处测定吸光度(A)值。 1.2.5 细胞周期检测

0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，冰冷磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2 次，预冷的70%乙醇固定，4 ℃过夜，上机前离心除去乙醇，PBS清洗3 次，100 mg/L RNase A 37 ℃消化40 min；加入1 mL 100 μg/mL碘化丙啶溶液，4 ℃避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞DNA含量。 1.2.6 细胞凋亡检测

将细胞消化后接种于6 孔板，培养24 h。细胞经胰酶消化后，取100 μL置于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 100 μg/mL碘化丙啶溶液，混匀后室温避光孵育20 min，然后加入400 μL PBS缓冲液，流式细胞仪进行凋亡检测。 1.3 统计分析

计量数据以x±s表示，应用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间差异比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 RNAi对CD147表达影响(图 1、2)

通过RT-PCR(图 1)和Western blot(图 2)鉴定CD147在细胞中基因和蛋白水平的表达变化。与AI/Scramble组CD147 mRNA(0.79±0.08)和蛋白表达(0.85±0.11)比较，AI/shCD147组CD147 mRNA(0.39±0.06)和蛋白表达(0.31±0.05)均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图 1 RT-PCR鉴定转染RNAi载体后CD147 mRNA表达

图 2 Western blot鉴定转染RNAi载体后CD147蛋白表达
2.2 CD147沉默对LNCaP-AI细胞增殖活性影响(图 3)

与阴性对照比较，CD147干扰组细胞培养至第6 d 时，细胞生长速度减慢，至第8、10 d 细胞生长明显受到抑制(P<0.05)。

注：与对照组比较，a P<0.05。 图 3 CD147沉默对LNCaP-AI细胞生长影响
2.3 CD147沉默对LNCaP-AI细胞周期影响(表 1)

与对照组比较，CD147沉默组细胞周期出现G0/G1期细胞百分率增加；S期和G2/M期细胞百分率减少，表现为G0/G1期阻滞。

表 1 CD147沉默对LNCaP-AI细胞周期影响(%,x±s,n=3)
2.4 CD147沉默对LNCaP-AI细胞凋亡影响(表 2)

流式细胞仪检测结果表明，与对照组比较，CD147沉默组LNCaP-AI细胞凋亡无明显变化。

表 2 CD147沉默对LNCaP-AI细胞凋亡影响(%,x±s,n=3)
3 讨 论

在美国，PCa占男性恶性肿瘤发病率的第1位，肿瘤致死率的第2位[6]。随着社会老龄化和生活方式的改变，中国PCa发病率逐年增高[7]。早期患者适合前列腺癌根治术，雄激素阻断疗法(androgen deprivation therapy,ADT)有效。然而，绝大多数患者最终由ADPC转化为AIPC，ADT治疗无效，继而引起肿瘤复发和转移[8]。AIPC是PCa病程中的致死性阶段，尚无有效的治疗手段[8]。因此，明确AIPC机制并探索有效的治疗手段具有重要意义。LNCaP细胞系保留人的PCa特征，其生长具有很强的雄激素依赖性，表达前列腺特异抗原(prostate specific antigen,PSA)和雄激素受体，可在雄性裸鼠上成瘤。在此基础上，经过体外实验诱导产生的LNCaP-AI细胞亚系，能够在活性碳处理的血清或去势宿主的环境下生长，同时伴PSA持续升高。该模型可以模拟临床上内分泌治疗过程中PCa由激素依赖发展为激素非依赖的过程，为AIPC机制和治疗研究提供了理想平台[5, 9]。

CD147在PCa中表达增高，参与肿瘤细胞转移和侵袭等生物学行为[1, 2]。本研究利用RNAi技术，将靶向CD147基因的干扰载体转染LNCaP-AI细胞，通过G418筛选后获得稳定低表达CD147的细胞模型，结果显示,CD147沉默后细胞增殖明显受到抑制。细胞在增殖、分化和凋亡方面的异常均与肿瘤的发生和发展有关，其中细胞周期紊乱和抗凋亡的发生是肿瘤发生的机制之一。细胞周期过程为G1-S-G2-M期，G1期为DNA合成前期，标志细胞进入增殖态，增殖旺盛的细胞G1期持续时间短。S期为DNA合成和复制期。G2、M期分别为DNA合成后期及有丝分裂期。细胞周期G1→S、G2→M异常将使细胞周期发生紊乱、细胞增殖失控，最终发生癌变。本研究结果表明，CD147沉默后LNCaP-AI细胞中G1期比例增多、S期比例减少，但细胞凋亡无明显变化。提示CD147通过改变G0/G1和G1/S期细胞转换而影响LNCaP-AI细胞生长和增殖。

参考文献
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