中国公共卫生  2014, Vol. 30 Issue (7): 912-915   PDF    
引用本文
张娟, 白宝琴, 李莉, 殷丽天, 关丽, 杨建一. AT1R和eNOS在盐敏感性高血压发生中作用[J]. 中国公共卫生, 2014, 30(7): 912-915.
ZHANG Juan, BAI Bao-qin, LI Li, et al. Effect of AT1R and eNOS on salt-sensitive hypertension in rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2014, 30(7): 912-915.
AT1R和eNOS在盐敏感性高血压发生中作用
张娟1, 白宝琴2, 李莉1, 殷丽天1, 关丽1, 杨建一1     
1. 山西医科大学基础医学院细胞生物与遗传学教研室, 山西 太原 030001;
2. 大同市第三人民医院
数字出版日期：2014-6-5 17:13.
基金项目：山西省自然科学基金（200811076-1）
作者简介：张娟（1982- ），女，山西太原人，讲师，硕士，研究方向：多基因病的分子遗传学。
通讯联系人：杨建一,E-mail：jianyiyang@163.com
摘要：目的 探讨血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在盐敏感性高血压发生发展中的作用。方法 用乳鼠皮下注射辣椒辣素法建立模型。哺乳期后，大鼠随机分成4组：对照组、高盐组、辣椒辣素组、辣椒辣素+高盐组，喂养4周后处死大鼠，免疫组化检测大鼠腹主动脉AT1R和eNOS蛋白表达，反转录-聚合酶链式反应检测大鼠腹主动脉AT1R和eNOS mRNA表达。结果 与对照组比较，辣椒辣素组大鼠动脉AT1R蛋白表达量增加0.70倍（P<0.01），而动脉eNOS 蛋白表达量降低20.5%（P<0.05），eNOS mRNA的表达降低0.80倍（P<0.05）；与对照组比较，辣椒辣素+高盐组大鼠动脉AT1R蛋白表达量增加1.69倍（P<0.01），AT1R mRNA表达量提高1.70倍（P<0.01），而动脉eNOS蛋白表达量降低60.2%（P<0.01），eNOS mRNA表达降低2.52倍（P<0.01）。结论 感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠动脉AT1R表达升高，同时eNOS表达降低，AT1R和eNOS表达水平的差异可能与盐敏感性高血压的形成有关。
关键词： 盐敏感性高血压     血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)     内皮型一氧化氮合酶(eNOS)     大鼠    
Effect of AT1R and eNOS on salt-sensitive hypertension in rats
ZHANG Juan1, BAI Bao-qin2, LI Li1, et al    
Department of Cell Biology and Genetics, Shanxi Medical University, Taiyuan, Shanxi Province 030001, China
Abstract: Objective To explore the role of angiotensin Ⅱ 1 receptor(AT1R)and endothelial nitric oxide synthase(eNOS)in the development of salt-sensitive hypertension.Methods Newborn male Wistar rats were given capsaicin subcutaneously to establish the model.After weaning period,the rats were divided into 4 groups and fed with different salt diets for 4 weeks:control of normal sodium diet(CON-NS),control of high sodium diet(CON-HS),capsaicin pretreatment plus normal sodium diet(CAP-NS),and capsaicin pretreatment plus high sodium diet(CAP-HS).The rats were killed after 4 weeks treatment.Immunohistochemistry was performed to detect the expression of AT1R and eNOS proteins in the artery.The expression of AT1R and eNOS mRNA in the artery was determined by reverse transcription polymerase chain reaction.Results Compared with the CON-NS rats,the expression of AT1R protein in the artery was remarkably higher in the CAP-NS rats(P<0.01),while the expression of eNOS mRNA and protein in the artery were remarkably decreased in the CAP-NS rats(P<0.05).Compared with the CON-NS rats,the expression of AT1R mRNA and protein in the artery was remarkably higher in the CAP-HS rats(P<0.01),while the expression of eNOS mRNA and protein in the artery was remarkably decreased in the CAP-HS rats(P<0.01).Conclusion The expression of AT1R mRNA and protein increase,and the expression of eNOS mRNA and protein decrease in the artery of the salt-sensitive hypertensive rats induced by sensory denervation.The different expressions of AT1R and eNOS may be related with the pathogenesis of salt-sensitive hypertension.
Key words: salt-sensitive hypertension     angiotensin Ⅱ 1 receptor     endothelial nitric oxide synthase     rat    

盐敏感性高血压指由于相对高盐摄入所引起的血压升高[1, 2, 3, 4]。盐敏感性高血压的发生与多种因素相关，包括神经内分泌系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、遗传、环境等。目前，已有许多学者和科学家在此领域进行了大量研究，但仍未完全揭示盐敏感性高血压的细胞及分子机制。本研究通过建立感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠模型，观察肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)基因血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin II 1 receptor，AT1R)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)在模型大鼠动脉中表达差异，探讨其在盐敏感性高血压发病机制中作用，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验动物

健康清洁级雄性Wistar大鼠40只，由山西医科大学生理学系动物室提供并繁殖饲养，出生体重8~9 g。饲养条件为(24±2)℃，相对湿度为(55±10)%。生产许可证号码：SCXK(晋)2009-0001，动物使用许可证号码：SYXK(晋)2009-0004。 1.2 试剂与仪器

辣椒辣素(capsaicin，CAP)(美国Sigma公司)；苏木素(上海润捷化学试剂有限公司)；eNOS、AT1R兔抗鼠多克隆抗体、免疫组化试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)；反转录-聚合酶链式反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。YD-202A型石蜡切片机(浙江金华市益迪医疗设备厂)；PCR扩增仪(英国Progene Techne公司)；DYY-7C型电泳仪(北京六一仪器厂)；JY-SPCT水平电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)；Neofuge15R台式高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司)；Tanon2500凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；UV-2602型紫外分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；BL-410生物信号显示与处理系统(成都泰盟电子有限公司)。 1.3 指标与方法 1.3.1 动物模型建立及分组

参照文献[5]建立模型，新生雄性Wistar大鼠出生后第1～2 d，皮下一次性注射辣椒辣素50 mg/kg(溶解在5%乙醇、5%吐温80生理盐水中)；对照组皮下注射同体积溶液，哺乳期(4周龄)后，大鼠随机分成4组，每组10只：对照组(饲料中含1%NaCl)，高盐组(饲料中含4%NaCl)，辣椒辣素组(饲料中含1%NaCl)，辣椒辣素+高盐组(饲料中含4%NaCl)，4组大鼠分别饲养4周(8周龄)后进行各项指标检测。 1.3.2 称重、测血压及取材

每周分别称体重，用尾套法测量大鼠清醒时尾收缩压，测3次取均值。标本取材参照汪新良等[6]方法，用20%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，用生理盐水灌注10 min，随后用含0.1 mg/mL硝普钠生理盐水灌注5 min，再用1.5%戊二醛磷酸缓冲液做初步灌注固定(灌注速度每100 g体重1 mL/min)，至主动脉变硬后，取出腹主动脉，3%戊二醛缓冲液固定24 h。仔细剥离血管周围结缔组织，将剥离好血管分为2份，1份置于冻存管中，液氮保存，准备行RT-PCR检测，1份用于免疫组化检测。 1.3.3 大鼠动脉AT1R、eNOS蛋白表达检测

采用免疫组化法，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析大鼠动脉AT1R和eNOS表达水平，以吸光度(A)值表示其相对含量。 1.3.4 大鼠动脉AT1R、eNOS mRNA表达检测

采用RT-PCR法，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。从NCBI(National Center for Biotechnology Information)的nucleotide中查得目的基因(AT1R，transcript ID：NM_030985.4；eNOS，transcript ID：NM_021838.2)，用Primer Premier 5.0 设计引物，其中，AT1R上游引物：5′-GAGAGGATTCGTGGCTTGAG-3′，下游引物5′-TAAGTCAGCCAAGGCGAGAT-3′；eNOS上游引物：5′-TCGTTCAGCCATACATC-3′，下游引物5′-CAGCCACATCCTCAAGTA-3′。以β-actin作为内参[7]，进行产物半定量分析，比值表示其相对含量。 1.4 统计分析

实验结果以±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较，采用最小显著差法，相关性采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 各组大鼠体重变化

各组大鼠实验前体重无差异，在实验过程中，各组大鼠体重均增长，分组后第4周，各组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。 2.2 各组大鼠收缩压变化(表 1)

各组大鼠在分组时(0周)鼠尾收缩压差异无统计学意义(P>0.05)；分组后第3、4周，与对照组比较，辣椒辣素+高盐组大鼠鼠尾收缩压明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1 各组大鼠鼠尾收缩压(mmHg，x±s，n=10)
各组大鼠AT1R和eNOS蛋白表达变化(图 1)

2.3 与对照组比较，辣椒辣素组和辣椒辣素+高盐组大鼠动脉AT1R蛋白相对表达量分别增加了0.70和1.69倍，差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较，辣椒辣素组和辣椒辣素+高盐组大鼠动脉eNOS蛋白表达量分别降低了20.5%和60.2%(P<0.05)。相关性分析表明，大鼠动脉AT1R蛋白表达与eNOS蛋白表达呈负相关(r=-0.899，P<0.01)。

注：A：AT1R蛋白表达；B：eNOS蛋白表达；与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。 图 1 各组大鼠动脉AT1R和eNOS蛋白表达
2.4 大鼠动脉AT1R和eNOS mRNA表达变化(图 2)

辣椒辣素+高盐组AT1R mRNA(464 bp，图 2A)表达量比对照组高1.70倍(P<0.01)。与对照组比较，辣椒辣素+高盐组和辣椒辣素组eNOS mRNA(470 bp，图 2B)表达量分别降低了2.52和0.80倍(P<0.05)。相关性分析结果表明，大鼠动脉AT1R mRNA表达与eNOS mRNA表达呈负相关(r=-0.967，P<0.01)。

注：1：对照组；2：高盐组；3：辣椒辣素组；4：辣椒辣素+高盐组；M：DNA marker。 图 2 各组大鼠动脉AT1R和eNOS mRNA表达电泳图
3 讨 论

RAS 是人类及哺乳动物体内一种重要的激素调节系统，对心血管系统发育、电解质和体液平衡、血压调节起着重要的作用[8]。血管紧张素II是RAS的主要效应分子，血管紧张素II的大多数生理效应通过AT1R完成[9]。AT1R的激活促进血压的升高和高血压终末器官的损害[10]。本研究结果显示，与对照组比较，辣椒辣素+高盐组(感觉神经损伤性盐敏感性高血压)大鼠动脉AT1R mRNA和蛋白表达均升高。与Georg 等[11]研究结果一致。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是心血管系统内皮功能舒张的一种重要调节因子，研究认为，eNOS异常可影响血浆中NO水平[12]。本研究结果表明，与对照组大鼠比较，感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠动脉eNOS在mRNA和蛋白表达明显降低。研究表明,在Dahl 盐敏感性高血压大鼠中，4%NaCl饮食10周，动脉eNOS的活性明显下调以及NO的生物利用度受损[13]。使用药物阻止动脉eNOS下调对终末器官的损伤具有保护作用，血管eNOS表达下调与动脉血压的升高及心血管疾病的发生密切相关。

本研究结果显示，AT1R在mRNA和蛋白水平的表达均与eNOS的表达呈负相关，进一步证实了AT1R和eNOS的平衡对于高血压的发生发展至关重要。提示AT1R和eNOS相互作用可能是感觉神经损伤性盐敏感性高血压的发生机制之一。

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