近年来，氟对软组织的影响已引起越来越多的关注^{[1, 2, 3]}。目前认为慢性氟中毒致细胞受损的主要机制是氟可诱导高水平的氧化应激^[4]。但是慢性氟中毒时，活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生的最原始原因是什么还不清楚。研究发现，慢性氟中毒大鼠线粒体融合蛋白表达下降，同时线粒体电镜下变得易分裂^{[5, 6]}。当线粒体分裂亢进时，线粒体电子呼吸链受影响，部分电子传递过程障碍，易产生超量氧自由基，而机体抗氧化系统又无法及时清除。提示，线粒体受损可能是慢性氟中毒时细胞高氧化水平的原因之一。本研究通过对氟处理体外培养人脑神经母细胞瘤细胞株(a human neuroblastoma cell，SH-SY5Y)线粒体形态和氧自由基含量的观察，为深入研究氟中毒性脑损伤机制提供依据。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

氟化钠(NaF，昆明合起工贸有限公司)，改良杜氏伊格尔培养基(Dulbeccos modified eagle medium，DMEM)(英国Gibco Introvagen公司)；SH-SY5Y细胞(德国German Cellection of Microorganisms and Cell Cultures公司)；活体细胞线粒体形态荧光染色试剂盒Mito Tracher RED和细胞内氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒(美国Genmed Scientifics 公司)。电热恒温水浴锅(北京市光明医疗仪器厂)；倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)。 1.2 细胞培养与分组处理

将冻存的SH-SY5Y细胞株复苏于37 ℃、CO₂培养箱中，24 h后换培养基(含10%胎牛血清、1:100双抗的DMEM)继续培养。观察细胞生长状态，待细胞长满培养瓶底传代继续培养。在SH-SY5Y细胞中加入不同浓度(0.4、4 mmol/L)的NaF处理，对照组加入双蒸水，作用时间为6、12、24、48 h^[7]。 1.3 SH-SY5Y细胞ROS水平测定

取体外培养的各组SH-SY5Y细胞，按试剂盒说明书操作，激发波长490 nm，发射波长520 nm，细胞浆内荧光增强，表明ROS含量增高。荧光亮度判断标准为：1级：无或可见微弱自发荧光；2级：仅能见明确可见荧光；3级：可见明亮荧光；4级：可见耀眼荧光。ROS水平表达方式为在100倍光镜下，每100个细胞中2~4级荧光细胞数目。实验重复10次。 1.4 线粒体形态染色观察

取体外培养的各组SH-SY5Y细胞，按试剂盒说明书操作，试剂盒中荧光染料可自由通过细胞膜，特异性结合线粒体膜，激发红色荧光，使线粒体染红色。线粒体形态判断标准为：Ⅰ型(融合-分裂平衡型线粒体)为完全的管状连接膜网络，或<50%线粒体呈小球小泡状膜结构；Ⅱ型(融合障碍-分裂亢进型线粒体)为完全小球小泡状膜结构，或> 50%线粒体呈小球小泡状膜结构。线粒体形态计数：在400倍光镜下，计数每100个细胞Ⅱ型线粒体数目，同时确认细胞线粒体形态。实验重复10次。 1.5 统计分析

数据采用x±s表式，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料经单样本K-S检验，服从正态分布，多组间和组内计量资料采用重复测量的方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 氟对SH-SY5Y细胞内ROS水平影响(图 1、表 1)

结果显示，染氟SH-SY5Y细胞ROS荧光染色异常，染氟时间越长，氟离子浓度越高，ROS水平越高，体外培养细胞ROS水平与氟离子浓度及染氟时间呈正相关(P<0.05)。

图 1

注：ABC：对照组;DEF：0.4 mmol/L染氟组;GHI：4 mmol/L染氟组;ADG：作用6 h;BEH作用24 h;CFI作用48 h；箭头所指即阳性神经细胞。 图 1 氟对SH-SY5Y细胞内ROS水平影响(荧光染色，x±s×100)

表 1

表 1 氟对SH-SY5Y细胞内ROS含量影响(个/100细胞，x±s，n=10) 组别 (mmol/L) 作用时间(h) 6 12 24 48 对照组 7.2±1.5 7.4±1.3 7.7±1.6 10±2.2 NaF 0.4 15.1±1.4 12.8±2.5 22.6±2.4a 30±3.1a          4.0 32.5±1.9 38.1±2.2a 69.3±3.1ab 84.3±3.5ab 注：与对照组比较，a P<0.05;与NaF 0.4 mmol/L组比较，b P<0.05。

表 1 氟对SH-SY5Y细胞内ROS含量影响(个/100细胞，x±s，n=10)

对照组SH-SY5Y细胞线粒体融合分裂功能正常；经氟处理SH-SY5Y细胞线粒体分裂亢进，SH-SY5Y细胞线粒体分裂程度随着氟离子浓度增加和处理时间延长而加强。

表 2

表 2 氟对SH-SY5Y细胞II型线粒体形态影响(个/100个细胞，x±s，n=10) 组别 (mmol/L) 作用时间(h) 6 12 24 48 对照组 7.6±1.5 10.4±2.6 7.9±1.7 11.6±2.1 NaF 0.4 13.0±1.4 15.0±1.7 22.9±1.9a 23.7±1.6a          4.0 15.2±2.3 23.8±1.8a 29.1±4ab 47.7±3.3ab 注：与对照组比较，a P<0.05;与NaF 0.4 mmol/L组比较，b P<0.05。

表 2 氟对SH-SY5Y细胞II型线粒体形态影响(个/100个细胞，x±s，n=10)

在慢性氟中毒发病机制中，高氧化应激学说被大部分学者认同^{[3, 4]}。但是，高水平氧自由基的来源还不清楚。以往发现，慢性氟中毒时线粒体形态和功能改变，这可能导致线粒体不完整电子传递而产生过多ROS^{[5, 6]}。

本研究结果显示：染氟(0.4、4 mmol/L)体外培养SH-SY5Y细胞6、12、24、48 h均可见不同程度的绿色荧光，且细胞内ROS水平随染氟量和染氟时间增加而升高(P<0.05)，染氟SH-SY5Y细胞线粒体分裂亢进，线粒体显示红色小泡小点状结构，氟处理的细胞出现不同程度的线粒体分裂增强，呈时间、剂量效应(P<0.05)。与以往实验结果一致^[4]。ROS作为内源性氧化损伤物质，可通过损伤脂质膜或者抗氧自由基酶直接损伤线粒体，诱发线粒体呈现分裂亢进；引起线粒体膜电位改变、线粒体三磷酸腺苷产能减少，同时可以通过B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)相关凋亡蛋白诱导细胞凋亡；同时线粒体损伤继而产生不成熟电子呼吸，产生大量超氧自由基，进一步引发高氧化应激；但是氟中毒时，高水平ROS的始因有待进一步研究。