随着医学遗传学及分子生物学发展，人们在探讨地方性氟中毒病因时，越来越重视将遗传因素与环境因素结合起来进行研究。从单纯的危险因素分析过渡到揭示暴露因子与遗传特征的联合作用，深入氟中毒遗传易感性的研究对于制定其控制措施有着实质性意义。成釉蛋白基因(ameloblastin，AMBN)是一种牙胚发育特异性基因^[1]，人AMBN基因(23 kb)定位于4q21，共有13个外显子，编码一种含447个氨基酸的蛋白产物—成釉蛋白^{[2, 3]}。AMBN在氟斑牙的形成机制中具有重要地位，研究表明AMBN基因的7号外显子(538_540delGGA)和13号外显子(986C>T)多态性可能是氟中毒易感因素之一^[4]。本研究在重庆地区采用1∶1病例对照研究方法，探讨AMBN基因的7号外显子(538_540delGGA)和13号外显子(986C>T)多态性与环境危险因素在燃煤型氟中毒中的交互作用。结果报告如下。 1 对象与方法 1.1 对象

在重庆市13个地氟病乡镇中，随机抽取奉节、巫山县，在2县中分别随机抽取兴隆镇和笃坪乡121例氟中毒患者作为病例组，8～12岁患氟斑牙儿童100例(根据Dean法判定)，每县每个年龄组男、女各5例；氟骨症^{[5, 6]}患者21例，年龄为(45±12.53)岁；以年龄、性别、居住条件为匹配因素在当地选取121名非病人作为对照组。 1.2 方法 1.2.1 DNA提取

根据知情同意原则，抽取对象外周静脉血5 mL，置于肝素抗凝管中，-20 ℃保存。采用全血基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型，北京Bioteke公司)提取基因组DNA。 1.2.2 基因多态性分析

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(polymerase chain-reaction restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法，参照文献^[7]设计引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，引物序列分别为：7号(538_540delGGA)上游：5′-CATTGCAAACTCTTGGGTCATA-3′，下游:5′-GACCTTGTGGATCAGGAAAATC-3′；13号(986C>T)上游：5′-ATGGCATCTTTGACGAATGT-3′，下游：5′-ATCCTTAGGGAGAGCAAGGA-3′。PCR反应体系：Premix Taq 25 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 5 μL，补足灭菌蒸馏水至50 μL，混匀反应体系，瞬时离心后，用PCR扩增仪进行热循环扩增反应。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min；63 ℃(538_540delGGA)、57 ℃(986C>T)退火30 s，72 ℃延伸30 s,35个循环，72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物跑胶电泳(110 V，72 mA，40 min)，验证扩增产物，使用冷冻法对扩增产物进行提纯，纯化后的PCR产物用限制性内切酶BsaJ I 60 ℃、Bpm I 37 ℃恒温水浴消化16 h。 1.2.3 基因分型

取10 μL酶切产物，经3%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下判读结果，根据电泳条带的数目和位置判断基因型。7号外显子(538_540delGGA)GGA/GGA基因型只有404 bp 1个条带，GGA/-型出现27、174、203 bp 3个条带，-/-型出现27、347 bp 2个条带；13号外显子(986C>T)CC型出现311 bp 1个条带，CT型出现70、241 bp 2个条带。 1.2.4 全血化学元素及尿氟测定

用聚乙烯瓶采集病例与对照人群即时尿样于4～8 ℃运输保存，3 d内在重庆市疾病预防控制中心地方病防治所采用氟离子选择电极法测定尿氟含量；同时用真空抗凝管采集5 mL静脉血，于4～8 ℃运输保存，7 d内在重庆医科大学附属第二医院检验科采用原子吸收光谱法测定全血中铜、锌、钙、镁、铁含量。各元素参考值范围参照首都儿科研究所的修订数值^[8]与深圳市妇幼保健院对儿童微量元素研究所得数值相结合^[9]；正常人尿氟参考值为0.95 mg/L^[10]。 1.3 统计分析

采用直接计数法计算基因型及等位基因频率。应用SPSS 17.0软件包，以χ²检验比较基因型在病例和对照组中分布差异，应用条件logistic回归分析遗传因素、环境因素单独及遗传与环境在氟中毒人群中的交互作用，根据Khoury^[11]和Ottman^[12]提出的2型交互作用模型的交互作用系数(γ)判断交互作用存在与否以及交互作用的强度与方式。 2 结 果 2.1 AMBN基因多态性与地方性氟中毒关联分析(表 1)

(538_540delGGA)基因型与等位基因频率在病例组与对照组分布差异有统计学意义；相对于携带GGA/GGA基因型，携带GGA/-基因型人群氟中毒发病风险是其1.426倍，携带-/-(GGA完全缺失)基因型的个体患病的危险性是其4.427倍。携带(986C>T)CT基因型的个体患氟中毒的危险性高于CC基因型个体。

表 1

表 1 AMBN基因7、13号外显子基因型与等位基因频率分布 基因名称 类别 病例组 对照组 χ2值 P值 OR值 95%CI 例 % 例 % 538_540delGGA 基因型 GGA/GGA 74 61.16 91 75.21 9.396 0.009 1.000 0.006~0.010 GGA/- 29 23.97 25 20.66 1.281 0.258 1.426 0.770~2.643 -/- 18 14.87 5 4.13 9.018 0.003 4.427 1.569~12.490 等位基因频率 GGA 177 73.14 207 85.54 11.344 0.001 0.460 0.291~0.727 - 65 26.86 35 14.46 986C>T 基因型 CC 98 80.99 109 90.88 4.042 0.044 1.000 0.222~0.992 CT 23 19.00 12 9.92 4.042 0.044 2.132 1.008~4.510 TT 0 0 等位基因频率 C 219 90.50 230 95.04 3.727 0.054 0.497 0.241~1.023 T 23 9.50 12 4.96

表 1 AMBN基因7、13号外显子基因型与等位基因频率分布

对病例与对照人群尿氟及血锌、钙、镁、铁进行logistic回归分析发现，病例组与对照组间仅尿氟分布差异有统计学意义(χ²=4.111,P<0.05；OR=1.826，95%CI=1.020～3.269)，即尿氟水平≥0.95 mg/L人群发生氟中毒的风险是尿氟水平<0.95 mg/L人群的1.826倍。 2.3 (538_540delGGA)多态性与尿氟交互作用(表 2)

尿氟水平≥0.95 mg/L和-/-基因型在人群氟中毒中存在交互作用(γ=1.534)；-/-基因型与尿氟水平≥0.95 mg/L在氟中毒中交互作用机制可能为次相乘模型。

表 2

表 2 AMBN基因(538_540delGGA)多态性与尿氟水平交互作用分层分析 基因型 尿氟水平(mg/L) 病例组 对照组 OR值 95%CI GGA/GGA <0.95 30 56 1.000 GGA/- <0.95 11 14 1.467 0.593～3.682 -/- <0.95 5 3 3.111 0.695～13.922 GGA/GGA ≥0.95 18 11 3.055 1.278～7.301 GGA/- ≥0.95 8 4 3.733 1.038～13.421 -/- ≥0.95 6 2 5.600 1.064～29.470

表 2 AMBN基因(538_540delGGA)多态性与尿氟水平交互作用分层分析

尿氟水平≥0.95 mg/L和CT基因型在人群氟中毒中存在交互作用(γ=1.296)；CT基因型与尿氟水平≥0.95 mg/L在氟中毒中交互作用机制可能为次相乘模型。

表 3

表 3 AMBN基因(986C>T)多态性与尿氟水平之间的交互作用分层分析 基因型 尿氟水平(mg/L) 病例组 对照组 OR值 95%CI CC <0.95 32 60 1.000 CT <0.95 10 6 3.125 1.041～9.381 CC ≥0.95 15 9 3.125 1.232～7.929 CT ≥0.95 7 3 4.375 1.059～18.080

表 3 AMBN基因(986C>T)多态性与尿氟水平之间的交互作用分层分析

基因多态性是影响个体患病与否主要原因之一，综合分析突变基因型与环境危险因素之间的交互作用，对于氟中毒的一级预防非常重要。Khoury^[11]和Ottman^[12]等提出并建立了基因环境交互作用分析的6种模型，并根据2型交互模型建立了交互作用评价方法，可对于基因与环境因素的交互作用以及交互作用剂量-反应关系的强度加以评价^[13]。

本研究结果显示，AMBN基因7号外显子(538_540delGGA)突变基因型(GGA/-和-/-)是氟中毒的易感基因型，个体携带GGA/-或-/-基因型可能增加氟中毒风险，且纯合突变型(-/-)的风险更大(OR=4.427)；(538_540delGGA)-/-型与尿氟≥0.95 mg/L的交互作用OReg=1.723、γ=1.543，提示尿氟水平≥0.95 mg/L和-/-基因型在燃煤型氟中毒的发生过程中存在交互作用。本研究结果表明，13号外显子(986C>T)CT基因型可能是氟中毒易患因素，CT基因型与尿氟≥0.95 mg/L的交互作用OReg=4.375、γ=1.296，提示尿氟水平≥0.95 mg/L和CT基因型在氟中毒发生过程中也存在交互作用。本研究结果还表明，儿童氟斑牙患病率与成人氟骨症患病率均与摄氟量呈正相关，与尿氟<0.95 mg/L人群比较，尿氟≥0.95 mg/L人群患氟中毒的可能性高于对照人群(OR=1.826)，提示尿氟水平≥0.95 mg/L可能是该人群发生氟中毒的危险因素。