中国公共卫生  2014, Vol. 30 Issue (5): 661-663   PDF    
引用本文
张婷, 崔戈, 章林平, 李阳, 张晓岚, 周洪昌, 顾福萍. 结直肠腺癌KIAA1199基因表达与临床病理学相关性[J]. 中国公共卫生, 2014, 30(5): 661-663.
ZHANG Ting, CUI Ge, ZHANG Lin-ping, et al. Associations of KIAA1199 expression with clinicopathological features and prognosis in colorectal adenocarcinoma patients[J]. Chinese Journal of Public Health, 2014, 30(5): 661-663.
结直肠腺癌KIAA1199基因表达与临床病理学相关性
张婷1, 崔戈2 , 章林平1, 李阳1, 张晓岚2, 周洪昌1, 顾福萍1    
1. 湖州师范学院医学院, 浙江 湖州 313000;
2. 湖州师范学院附属第一医院
数字出版日期：2014-4-8 11:36
基金项目：浙江省公益性技术应用研究计划（2013C37031）；浙江省医学会临床科研资金（2012ZYC-A61）；湖州市科技计划项目（2013GY19）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310347015）
作者简介：张婷（1981-），女，江苏泰州人，讲师，硕士，研究方向：消化系肿瘤病理研究。
通讯联系人：崔戈，E-mail:witcui@qq.com
摘要：目的 探讨KIAA1199基因在结直肠腺癌中的表达与临床病理特征及预后的相关性及临床意义。方法 采用实时定量PCR法（qPCR）检测手术切除结直肠腺癌及癌旁正常组织KIAA1199 mRNA表达；采用免疫组织化学染色（IHC）检测结直肠腺癌组织蜡块KIAA1199 蛋白原位表达；分别分析KIAA1199 mRNA、蛋白表达水平与患者临床病理特征及预后生存的相关性。结果 结直肠腺癌组织KIAA1199 mRNA水平（2-△△Ct=42.410 6±1.060 5）明显高于癌旁正常组织（2-△△Ct=1）（P<0.01），结直肠腺癌组织KIAA1199 mRNA水平与患者年龄、淋巴结及远处转移、临床分期呈正相关（P<0.01），与患者生存期呈负相关（P<0.01）；结直肠腺癌组织KIAA1199 蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织（阴性）（P<0.01），结直肠腺癌组织KIAA1199 蛋白表达水平与原发灶浸润深度及临床分期呈正相关（P<0.01），与患者生存期呈负相关（P<0.01）。结论 KIAA1199基因可作为一种较有价值的评估结直肠腺癌病程进展及预后的标志物。
关键词： KIAA1199基因     结直肠腺癌     临床病理学特征     预后    
Associations of KIAA1199 expression with clinicopathological features and prognosis in colorectal adenocarcinoma patients
ZHANG Ting1, CUI Ge2 , ZHANG Lin-ping1, et al    
School of Medicine, Huzhou Teachers College, Huzhou, Zhejiang Province 313000, China
Abstract: Objective To investigate correlations between KIAA1199 expression and clinicopathological features and prognosis in colorectal adenocarcinoma patients.Methods Real-time quantitative polymerase chain reaction(qPCR)was applied to detect the KIAA1199 mRNA expression levels in resected samaples of colorectal adenocarcinoma and the normal tissue adjacent to the carcinoma.Immunohistochemistry(IHC)was used to detect the KIAA1199 expression levels in paraffin blocks from the patients with colorectal adenocarcinoma.Kaplan-Meier survival curve was applied to analyze the correlation between KIAA1199 expression and survival of colorectal adenocarcinoma patients.Results KIAA1199 mRNA expression level of colorectal adenocarcinoma(2-△△Ct= 42.410 6 ± 1.060 5)was significantly higher than that of the normal tissue adjacent to the carcinoma(2-△△Ct=1)(P<0.01)and was correlated with the age of the patients, lymph node and tumor-node-metastasis(TNM)stage(P<0.01)and negatively correlated with survival time(P<0.01).IHC results showed that KIAA1199 protein expression levels of colorectal adenocarcinoma(83/100, 83.00%)was significantly higher than that of the normal tissue adjacent to the carcinoma(P<0.01)and was positively correlated with the invasion depth of primary tumor and TNM stage(P<0.01), and negatively correlated with survival time of the patients(P<0.01).Conclusion KIAA1199 can be considered as a valuable marker for the assessment of progression and prognosis of colorectal adenocarcinoma.
Key words: KIAA1199     colorectal adenocarcinoma     clinicopathological feature     prognosis    

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)在全世界及中国恶性肿瘤发病率均居第3位，并呈逐年上升趋势[1, 2]。中国结直肠癌患病率高达46.8/10万，发病率及死亡率以每年约4.2%的速度递增[3]。遗传、缺乏锻炼、慢性肠炎、精神因素及饮食结构失衡[4, 5, 6]等被认为是结直肠癌发生发展的危险因素。绝大多数结直肠癌来自于腺上皮的恶变。筛选有效、灵敏、可评估结直肠腺癌病程进展的分子标志物，对于结直肠癌早诊早治、改善患者预后、延长患者生存期具有重要意义。研究表明KIAA1199基因，在多种肿瘤尤其是结直肠癌中异常高表达，并可能在结直肠癌发生发展中发挥重要调控作用[7]。本研究通过分析结直肠腺癌组织KIAA1199 mRNA及蛋白表达水平与临床病理特征及预后生存期的相关性，进而探讨KIAA1199基因是否可作为有效评估结直肠腺癌病程进展的标志物。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 临床样本取材及预处理

所有样本提供者本人或其家属签署知情同意书，并经主管部门医学伦理委员会审查。选取医院临床生物样本库中2010年4月—2013年5月手术切除新鲜结直肠腺癌及癌旁正常组织共68对(男性42对，女性26对)。(1)手术切除新鲜组织，选取并剔出肿瘤组织及瘤旁远端正常组织，冰台上切碎、匀浆后取约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm体积分装入1.5 mL冻存管内，滴加RNA提取液(RNAlater RNA stabilization reagent,Qiagen)充分浸泡后置-80 ℃冰箱冻存备用。(2)选取湖州师范学院附属第一医院病理科2004年1月—2008年6月经病理确诊的结直肠腺癌(含正常组织区)蜡块组织100例(男性67例，女性33例)，另行切片，行免疫组化染色观察。上述所有样本中，结直肠腺癌患者中位年龄67岁(49～85岁)。 1.2 临床病理特征登记

登记结直肠腺癌患者性别、年龄；组织学信息：肿瘤部位、直径、瘤体数量、浸润深度、组织学分型、分化程度。恶性肿瘤国际临床病期分类(tumor-node-metastasis staging system，TNM)参照2009年美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)结直肠腺癌TNM分期系统(7版)[8]登记。通过电话随访调查患者生存状态，术后4周内死亡患者均排除，其中实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qPCR)样本患者随访期为2～36个月，共获得65例有效调查对象；免疫组化样本患者随访期为2～60个月，共获得96例有效调查对象。生存状态中截尾值定义为0，完整值定义为1(死亡)。 1.3 结直肠腺癌组织中KIAA1199 mRNA表达测定

采用qPCR法，取组织样品100 mg按Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA，进行PCR扩增。KIAA1199上游引物为：5'-CAGATGGACAAAGTGGAGCA-3'，下游：5'-TCAGCTTCAGGAACAACAGC-3'，扩增片段85 bp。以β-actin作为内参照，β-actin上游引物为5'-CCAACTAATGTTCAGCGTTA-3'，下游：5'-TACGATGATAGGAATGGTTG-3'，扩增片段400 bp。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共30个循环。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统扫描、拍照，分析数据。实验重复3次。采用比较Ct值法[9]统计KIAA1199 mRNA的相对表达量。以KIAA1199 mRNA相对表达量(2-△△Ct)的中间值将其分为高、低表达组，大于中间值者归为高表达组，小于中间值者归为低表达组。 1.4 结直肠腺癌组织KIAA1199蛋白原位表达检测

采用免疫组织化学染色法，按照试剂盒说明书操作。取蜡块组织，切片、贴片，65 ℃烘片过夜，二甲苯脱蜡、酒精洗脱、水洗，3%H2O2溶液中避光浸泡15 min，置入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)的高压锅内抗原修复3 min，自来水冲洗冷却，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，湿盒内滴加一抗KIAA1199(1:50)置4 ℃冰箱过夜。以已知阳性切片作为阳性对照，PBS替代一抗作为空白对照。次日PBS充分洗涤，滴加多克隆辣根过氧化物酶羊抗兔IgG二抗，室温孵育15 min，PBS清洗，滴加二氨基联苯氨显色液镜下控制显色，清洗、终止反应；苏木素复染，盐酸乙醇分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片，显微镜观察、拍照。由2位高年资病理医师分别进行双盲阅片。KIAA1199基因阳性对照表达为细胞胞浆呈现棕黄色颗粒。在组织背景清晰前提下，根据阳性细胞染色强度及其所占实质细胞百分比进行半定量评分[10]。≤4分(－～+)归为低表达组，≥5分(++～+++)归为高表达组。 1.5 统计分析

数据以x±s表示；采用SPSS 19.0统计软件，变量间相关性分析采用交叉列联表χ2检验。单因素生存分析采用Kaplan-Meier生存分析，Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 结直肠腺癌组织KIAA1199 mRNA表达与临床预后相关性 2.1.1 结直肠腺癌组织中KIAA1199 mRNA表达与临床病理特征相关性

结直肠腺癌组织KIAA1199 mRNA(2-△△Ct=42.410 6±1.060 5)明显高于癌旁正常组织(2-△△Ct=1)(P<0.01)；结直肠腺癌组织KIAA1199 mRNA相对表达量与患者年龄、淋巴结转移、远处转移及TNM分期呈正相关(P<0.01)，与肿瘤直径、分化程度及原发灶浸润深度呈正相关(P<0.05)，与患者性别、肿瘤部位及大体分型则无明显关联。 2.1.2 结直肠腺癌组织中KIAA1199 mRNA表达与患者生存期相关性(表 1)

结直肠腺癌组织KIAA1199 mRNA高表达组患者平均生存时间为24.736个月，中位生存时间为25个月；低表达组患者平均生存时间为28.725个月，中位生存时间为29个月；KIAA1199 mRNA高表达组病例生存期显著短于低表达组(χ2=4.8，P<0.05)。

表 1 结直肠腺癌KIAA1199 mRNA表达与生存期相关性
2.2 结直肠腺癌组织KIAA1199 蛋白原位表达与临床及预后相关性 2.2.1 结直肠腺癌组织KIAA1199蛋白原位表达与临床病理特征相关性

与癌旁正常组织(呈阴性)比较，结直肠腺癌组织KIAA1199蛋白表达显著增强(χ2=141.880,P<0.01)，高表达者占83%(83/100)。结直肠腺癌组织KIAA1199蛋白表达量与原发灶浸润深度及TNM分期、肿瘤大体分型及分化程度呈正相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、淋巴结及远处转移则无明显关联(P>0.05)。 2.2.2 结直肠腺癌组织中KIAA1199蛋白原位表达与患者生存期相关性(表 2)

结直肠腺癌组织KIAA1199 蛋白高表达组患者平均生存时间为20.488个月，中位生存时间为18.6个月；低表达组患者平均生存时间为46.171个月，中位生存时间为49个月；KIAA1199 蛋白高表达组患者生存时间显著短于低表达组(χ2=32.421，P<0.01)。

表 2 结直肠腺癌KIAA1199蛋白原位表达与生存期相关性
3 讨 论

KIAA1199 基因编码1361个氨基酸大分子蛋白(分子量约150 kD[11])，位于人类染色体组15q25.1，cDNA长度为5 776 bp。最早发现该基因突变与耳聋[11]有关，随后发现该基因异常在赋予细胞永生化及癌发生中具有重要作用[12]。近年来发现KIAA1199在人结直肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、头颈部癌、卵巢癌及胰腺癌[7, 13]中高表达，并可能通过调控Wnt信号通路参与肿瘤的发生发展[7]。但KIAA1199基因在结直肠腺癌中的表达水平与临床病理学特征的相关性研究较少。本研究采用IHC法检测了100例结直肠腺癌组织，显示KIAA1199基因在人结直肠腺癌中阳性染色部位均位于胞质，与癌旁正常组织比较，显著高表达(P<0.01)，且其蛋白表达水平与癌原发灶浸润深度及TNM分期呈正相关(P<0.01)，且与患者生存期呈负相关(P<0.01)；另外，本研究采用qPCR法检测了68例结直肠腺癌及癌旁正常新鲜组织的KIAA1199 mRNA表达，其mRNA表达水平与结直肠腺癌患者年龄、淋巴结及远处转移及TNM分期呈正相关(P<0.01)，且与患者生存期呈负相关(P<0.01)，mRNA表达与蛋白表达结果一致。有研究认为TNM分期结果是影响结直肠癌患者预后的较重要影响因素[14]。提示，KIAA1199基因可以作为一种较好的评估结直肠腺癌病程进展及预后生存状态的标志物。

参考文献
[1] Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer statistics,2010[J].CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300.
[2] Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin,2011,61(4):212-236.
[3] 陈琼 刘志才,程兰平,等.2003—2007年中国结直肠癌发病与死亡分析[J].中国肿瘤,2012,21(3):179-182.
[4] 安庆玉,李晓枫,高晓虹,等.大肠癌与饮食相关危险因素病例对照研究[J].中国公共卫生,2010,26(7):892-893.
[5] 陈俊,朱红岗,夏丽琴,等.结肠癌饮食危险因素病例对照研究[J].中国公共卫生,2010,26(4):441.
[6] 刘桃成,廖嫦英,梁维君,等.青年人大肠癌影响因素病例对照研究[J].中国公共卫生,2012,28(9):1144-1146.
[7] Birkenkamp-Demtroder K,Maghnouj A,Mansilla F,et al.Repression of KIAA1199 attenuates Wnt-signalling and decreases the proliferation of colon cancer cells[J].Br J Cancer,2011,105(4):552-561.
[8] Sobin LH,Gospodarowicz MK,Wittekind Ch.Eds.TNM classification of malignant tumors[M].7th,Oxford:Wiley-Blackwell,2009:310.
[9] Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-delta delta C(T))method[J].Methods,2001,25(4):402-408.
[10] 许良中,杨文涛.免疫组织化学反应结果的判定标准[J].中国癌症杂志,1996,6(4):229-231.
[11] Abe S,Usami S,Nakamura Y.Mutations in the gene encoding KIAA1199 protein,an inner-ear protein expressed in Deiters' cells and the fibrocytes,as the cause of nonsyndromic hearing loss[J].J Hum Genet,2003,48(11):564-570.
[12] Michishita E,Garces G,Barrett JC,et al.Upregulation of the KIAA1199 gene is associated with cellular mortality[J].Cancer Lett,2006,239(1):71-77.
[13] Kuscu C,Evensen N,Kim D,et al.Transcriptional and epigenetic regulation of KIAA1199 gene expression in human breast cancer[J].PLoS One,2012,7(9):e44661.
[14] 黄甜,聂绍发,柳巍,等.大肠癌患者生存时间影响因素分析[J].中国公共卫生,2008,24(1):73-74.